添加生物饲料对肉牛大理石纹相关基因表达的影响
摘要：为探究日粮中添加生物饲料对肉牛肉质的影响，将随机选择的年龄（28～29月龄）、体型相近的40头日本和牛×秦川牛杂交 F1 育肥阉牛，随机分为对照组和试验组，分别添加0%和8%的生物饲料；饲养期为5个月，每个月进行一次体重测定；饲养试验结束后，每组随机挑14头进行屠宰，测量12～13肋间眼肌面积，并对大理石纹进行评分；采用实时荧光定量 PCR 技术检测试验组和对照组背最长肌甲状腺球蛋白（TG）、过氧化物酶体增殖物激活受体 α（PPARα）和过氧化物酶体增殖物激活受体 β（PPARβ）基因的表达量。结果表明，试验组的眼肌面积大小和大理石纹评分极显著高于对照组（P＜0.01）；试验组牛 TG 和 PPARα 基因表达量显著高于对照组（P<0.05），PPARβ 基因表达量高于对照组，但未达显著水平（P＞0.05）。由此表明,日粮中添加活性干酪乳杆菌和酿酒酵母生物饲料可上调与动物脂肪代谢相关基因 PPARα 和与肉牛大理石花纹脂肪沉积相关基因 TG 的表达，促进肉牛肌内脂肪（IMF）沉积，提升牛肉大理石花纹等级。
随着社会经济的迅速发展，人们对高品质牛肉的需求与日俱增。肌内脂肪（intramuscular fat, IMF）可对牛肉品质和脂肪沉积产生积极影响，与个体的生长发育及屠宰性能紧密相关，肌内脂肪含量达到0%便能呈现理想的大理石花纹，才可被称作高档牛肉。试验证实，过氧化物酶体增殖激活受体（peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs）家族基因在动物脂肪代谢过程中起着重要的调控作用，根据结构的不同可分为 PPARα、PPARβ 和 PPARγ 三种亚型，具有调节脂肪代谢、炎症反应、脂肪细胞生长分化等功能。国外学者证实三碘甲腺原氨酸和甲状腺球蛋白（Thyroglobulin, TG）与肉牛大理石花纹脂肪沉积相关，并且还出现了商品化的基因测试。此外，该基因端多态性与提高脂肪总量相关，是大理石花纹沉积的标志基因。我国在21世纪初便开始对生物饲料的探索，出现以发酵技术和生物活性添加剂为主的饲料添加产品。其中，巴斯德生物饲料是将液态添加剂干酪乳杆菌、饲料添加剂酿酒酵母等与饲料原料稻糠、饲料原料玉米胚芽饼等按一定比例混合、发酵，制成的活性干酪乳杆菌和酿酒酵母产品，可提高奶牛产奶性能和肉牛的产肉性能。Butler 和 Kumar 团队研究发现肌肉组织和肉类的抗氧化能力取决于在饲料中作为最重要的内部因素的助氧化剂和抗氧化剂之间的平衡，以及肉中脂质的脂肪酸分布。通过在饲料中加入抗氧化剂或天然抗氧化剂，可以改善家禽和猪等非反刍动物肉类的氧化稳定性。对于反刍动物，瘤胃微生物菌群在吸收前会降低脂质不饱和的程度，并调节饲料成分对肉的影响。迄今为止，我国在应用生物饲料提高牛肉品质方面的研究还处于探索阶段。因此，本研究旨在通过添加活性干酪乳杆菌和酿酒酵母生物饲料饲喂肉牛，对试验牛进行宰前体重测量及宰后生产测定如大理石花纹面积测量和大理石花纹等级评分，采用 qRT-PCR 方法检测与大理石花纹沉积相关基因 TG 和与脂肪代谢相关基因 PPARα、PPARβ mRNA水平的表达量变化，探讨生物饲料饲喂影响肉牛脂肪沉积的相关分子机理，以期为高品质肉牛培育提供有价值的参考。
1 材料与方法
1.1 试验动物与试验设计
选择体况评分基本一致、28～29月龄的和牛×秦川牛杂交F1代育肥牛40 头作为试验用牛，随机分为试验组与对照组（每组20头牛）。日粮根据我国《肉牛饲养标准》（NY/T 815-2004）进行饲喂表1，试验组牛饲喂日粮中添加8%的生物饲料，对照组牛正常（即生物饲料添加量为0%）饲喂。饲喂预试期为 5月10日至19日（第1天给试验组添加2%的生物饲料，逐日增加至8%），饲喂正试验为5月20日至10月10日。
1.2 部分生长性能和屠宰性能的测定
体增重：在试验期的第1、30、60、90、120、150天上午对试验牛分别空腹称重并记录。眼肌面积测定：饲喂试验结束后，按照 《鲜、冻分割牛肉：GB/T 17238-2008》标准屠宰试验牛，将牛的二分胴体4℃排酸72h后，测定胴体12～13肋间背最长肌的横切面面积（先用硫酸纸绘出眼肌横切面的轮廓，然后再由眼肌面积测量板测定）。大理石花纹等级评分：按照《牛肉等级规格：NYT 676-2010》对大理石花纹肉评分，评分等级由低到高依次为1到5分，由3人同时评分取中值。
1.3 试验样品采集
饲喂试验结束后屠宰，立即从胴体第12～13肋骨间采集背最长肌，经无菌无 RNA 酶处理水冲洗后，剪切成小块（厚度约0.3cm）立即液氮冷冻保存，用于提取 RNA 后测定基因表达。
1.4 RNA 提取
采用 UNlQ-10 柱式 Trizol 总 RNA 抽提试剂盒（生工生物，编号：B511321），按照产品说明书提取牛背最长肌总 RNA，用 SMA4000 微量分光光度计检测总 RNA 的浓度，取3 μL 总 RNA 样品用1.5%琼脂糖凝胶电泳检查其完整性。
1.5 基因表达的测定
将总RNA反转录为cDNA。采用Primer Premier 5.0 设计 qRT-PCR 引物表2，并委托生工（上海）生物公司合成。用 β-actin 作为内参基因。
2.2 添加生物饲料对日本和牛×秦川牛F1育肥牛眼肌面积的影响
眼肌面积测量结果如表4所示，与对照组（83.63±3.94）cm2相比，试验组牛的眼肌面积（89.73±4.11）cm2显著增加了7.30%（P<0.01）。
2.3 添加生物饲料对日本和牛×秦川牛F1育肥牛大理石纹评分的影响
图1为试验牛大理石纹对比图，可以直观看出试验组牛较对照组肌内脂肪含量高，大理石花纹明显。图2是试验牛大理石纹等级评分分布，其中试验组5级牛有5头，4级牛有7头，分别占屠宰牛数的35.71%和50%, 均高于对照组的7.14%和35.71%；对照组中3级牛占比重最大，为对照组屠宰牛的50%，而试验组中3级牛仅占14.29%且无2级牛。试验组牛眼肌大理石花纹等级评分（4.21±0.69）极显著（P<0.01）高于对照组肉牛（3.43±0.75）。
2.3 添加生物饲料对日本和牛×秦川牛F1育肥牛大理石纹评分的影响
图1为试验牛大理石纹对比图，可以直观看出试验组牛较对照组肌内脂肪含量高，大理石花纹明显。图2是试验牛大理石纹等级评分分布，其中试验组5级牛有5头，4级牛有7头，分别占屠宰牛数的35.71%和50%, 均高于对照组的7.14%和35.71%；对照组中3级牛占比重最大，为对照组屠宰牛的50%，而试验组中3级牛仅占14.29%且无2级牛。试验组牛眼肌大理石花纹等级评分（4.21±0.69）极显著（P<0.01）高于对照组肉牛（3.43±0.75）。
2.4 添加生物饲料对日本和牛×秦川牛F1育肥牛TG/PPARα/PPARβ基因相对表达量的影响
由图3可知，与对照组相比，添加生物饲料的肉牛眼肌肉组织中 TG 基因和PPARα基因的表达量分别提高了94.44%和55.93%，差异均显著（P
3 讨论与结论
3.1 添加生物饲料对日本和牛×秦川牛F1育肥牛增重的影响
本试验结果表明日粮中添加生物饲料，可使肉牛的平均总增重和日增重分别提高11.78%和12.63%。可见日粮中添加活性干酪乳杆菌和酿酒酵母生物饲料的饲料模式可以提高育肥牛的整体增重水平。这种育肥效果是有理可循的，生物饲料中微生物中含有大量的益生菌，在动物体内产生一些具特殊的小肽物质，从而参与机体生理代谢、促进氨基酸和矿物质的吸收与富集，提高蛋白质的合成效率，饲料中添加活性干酪乳杆菌和酿酒酵母使胃肠环境产生抑菌能力，从而促进动物生长发育。此外，生物发酵饲料中的活性细胞进入瘤胃而刺激胃内容物的生成，使纤维分解菌和厌氧菌大量繁殖，从而提高了饲料的转化率。这与麻名汉和曹蕾等报道研究结论相似。段鹏杰在秦川牛日粮中添加谷氨酸渣，发现其可以显著提高育肥期公牛和育肥前、中期母牛的日增重，这与本研究对育肥期牛添加活性干酪乳杆菌和酿酒酵母的结果一致；高慧兰等在西门塔尔牛日粮中添加0.5%的酿酒酵母培养物对肉牛增重效果显著。吴道义等向2岁大小的杂交肉牛饲喂1%的酒糟生物饲料也可以显著提高肉牛体重，结论与本试验一致。
3.2 添加生物饲料对日本和牛×秦川牛F1育肥牛眼肌面积的影响
眼肌面积可作为评定牛屠宰后胴体品质的重要指标之一，且与肉牛肉的产出也存在紧密的关联性。结果显示试验组牛的眼肌面积较对照组大7.30%, 差异极显著（P
3.3 添加生物饲料对日本和牛×秦川牛F1育肥牛大理石花纹评分的影响
本试验经过评定得出，试验组肉牛屠宰评定的大理石纹等级较空白对照组提高了20.29%，差异显著（P<0.05）。耿春银在利木赞牛饲粮中添加酵母益生菌饲料可以获得更高的牛肉大理石纹（P
3.4 添加生物饲料对日本和牛×秦川牛F1育肥牛TG/PPARα/PPARβ基因相对表达量的影响
肌内脂肪（IMF）沉积与脂肪酸合成能力密切相关，当脂肪酸合成加强就提高了 IMF 含量，进而促进大理石花纹的形成。TG 基因与处于生长育肥期牛的大理石花纹性状显著相关；而 PPARs基因家族的主要作用是正向调控脂肪代谢相关基因的表达，从而控制脂肪酸的合成。本试验选用28～29月龄、处在肌内脂肪沉积期的肉牛，试验组牛背最长肌 TG 基因较对照组有显著（P<0.05）上调作用，李奎的研究表明复合酶制剂可以显著提高青年安格斯牛 TG 基因的表达水平，说明活性干酪乳杆菌和酿酒酵母等生物饲料可能促进青年牛 TG 基因的表达，进而提高牛的大理石花纹水平。苗海明研究不同营养水平对蒙古绵羊肌内脂肪沉积相关基因 mRNA 表达量的影响，发现低能量水平促进 PPARs基因的表达，高蛋白水平抑制了 PPARs基因的表达；魏巧丽在肉牛饲料中添加 β-胡萝卜素，可使 PPARs 表达量下降，使皮下脂肪和肌内脂肪分化水平受到抑制。日粮中添加活性干酪乳杆菌和酿酒酵母饲料在未改变牛日粮的营养水平的条件下，对 PPARα基因（P
4 结 论
本试验表明添饲活性干酪乳杆菌和酿酒酵母生物饲料对和秦F1育肥牛的体增重没有显著的提高作用，但在该饲料中的微生物中含有大量的益生菌，在动物体内产生一些具特殊的小肽物质，从而参与机体生理代谢、促进氨基酸和矿物质的吸收与富集，促进 PPARα（P<0.05）、TG（P<0.05）基因的表达，从而提高蛋白质的合成效率，使得试验组牛的眼肌面积较对照组增加7.6%和大理石纹等级评分提高20.29%。Lund 等发现脂类物质和蛋白质的氧化是肉类和肉类产品质量恶化的主要非微生物因素，通过在饲料中加入抗氧化剂或天然抗氧化剂，可以改善家禽和猪等非反刍动物肉类的氧化稳定性。因此猜测，活性干酪乳杆菌和酿酒酵母生物饲料是否有抗氧化剂成分从而改善了大理石纹，还需要更多的研究来验证。在基础日粮中添加活性干酪乳杆菌和酿酒酵母生物饲料进行育肥，可以显著提高日本和牛×秦川牛杂交F1牛的背最长肌组织中 TG、PPARα 基因的表达，并显著提高眼肌面积和大理石花纹评分等级，可为肉牛育肥的饲料配方提供基础资料。
生物发酵饲料的制作方法
生物发酵饲料不是什么高大上的东西，只要有专业的饲料发酵剂+原料就可以自己制作。所需的材料和设备都要求不高，具体做法是：
1.按照配方分别称取原料（参考配方1：玉米50%、豆粕或菜粕50%；参考配方2：60%全价配合饲料、豆粕40%；参考配方3:100%的猪鸡鸭全价饲料。配方中蛋白饲料越多效果越好。
2.选用含复合菌+复合酶制剂组合的酶菌结合饲料发酵剂，特别推荐选用“99多功能饲料发酵剂”这个发酵剂，500克/包，市场售价仅25元，发酵1-2吨饲料，使用量越大效果越好，菌种品种和数量多，且含丰富酶制剂分解饲料中的粗纤维效果好，且发酵完成的饲料香甜味和适口性更好。
3.将菌种溶于温水中半小时以上，加入少量红糖或糖蜜效果更好，然后均匀喷洒在发酵料中，边拌边洒，使发酵料的含水量达到手捏成团、落地即散的程度，一般料含水量55%-60%比较好。
4.将拌好的发酵饲料装于塑料桶或陶瓷缸中或水泥池内，稍将料压实后密封让其自然发酵。一般气温在25℃以下时，发酵时间为7--10天，气温在25℃以上时，则为3--5天。
5.发酵后，pH值达到4--5以下，并有浓郁的酒香味，即为发酵成功。
发酵饲料制作现场
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2020年已全面禁抗，我们之前经常在饲料中添加的抗生素进行促生长行为将是违法，否则面临巨额罚单。如何既能够促进动物生长又能够形成无抗养殖呢？其实中草药在促进畜禽养殖健康和生长、改善肉蛋奶品质大有可为，特别是将中草药发酵后效果提升4-28倍等好处，这个实施方案比你想象中效果更好，运用的没有不被效果折服的，值得尝试验证
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