枯草芽孢杆菌、酿酒酵母及其复合菌发酵棉粕营养成分变化的研究
枯草芽孢杆菌-1为石河子大学饲料生物技术实验室筛选；酿酒酵母(CICC 1001)购于中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)；棉粕、麸皮、糖蜜均由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司提供。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母浸出粉5g/L，氯化钠10g/L；YPD培养基：酵母浸出粉10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L。
称取棉粕84.1g、麸皮9.4g混匀，称取糖蜜6.5g溶于66mL蒸馏水中，加入底物中，充分混匀后称取30g于500mL三角瓶中，6层纱布封口，121℃灭菌20 min，冷却至室温。试验I组接种3％(3mL)的枯草芽孢杆菌种子液(活菌数约为1．925×108CFU/mL)；试验Ⅱ组接种酿酒酵母种子液(活菌数约为2.05×107CFU/mL）；试验Ⅲ组按3％的比例分别接种枯草芽孢杆菌-l和酿酒酵母种子液于发酵底物中(枯草芽孢杆菌：酵母菌=1：1)。混匀后于恒温培养箱中培养，试验I、Ⅱ、Ⅲ组培养温度分别为37、30、30℃，每12h振荡一次，发酵72h，发酵结束后将样品于45℃烘箱中干燥24h。每组9个重复。
感官评定：发酵72h后，每组随机抽取3个发酵饲料瓶的饲料进行感官评定。
常规营养成分指标：测定发酵前后样品CP、干物质(DM)、粗灰分(Ash)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗脂肪(EE)、钙(Ca)、磷(P)含量。
酸溶蛋白质含量：准确称取样品5.0g(精确至0.001g)，溶于15％三氯乙酸(TCA)溶液并稀释定容至50mL，混匀。将混合物静置5min，过滤，去除初滤液，滤液用作储备液。移取10～25mL滤液，按照粗蛋白质测定的步骤进行。
游离氨基酸含量：采用日立L-8900氨基酸自动分析仪测定，仪器条件：色谱柱SHISEIDO C18，4.6mm×250mm×5mm，进样量l0μL，柱温40℃，波长254 nm，流动相：A，0.1mol/L无水乙酸钠：乙腈=97：3(V/V)，混匀后调pH至6.5；B，乙腈：水=80：20(V/V)(表1)。样品前处理：取适量样品于离心管中，加入0.02 mol/L HCl 10 mL，涡旋1min，超声10min，避光静置2h。将上述溶液离心，分取1mL，加入1mL 7％磺基水杨酸，涡旋1min，避光静置1h。分取500μL，加入250 μL 0.1 mol/L异硫氰酸苯酯乙腈，250μL 1mol/L三乙胺乙腈，衍生1h。加入2mL正己烷，震荡，静置。分层后取下层过膜上机。
样品棉籽肽含量参考大豆肽粉(GB/T 22492—2008)的测定方法，样品酸溶蛋白质含量减去其中游离氨基酸的含量即为棉籽肽含量。
采用SPSS 25.0软件One-Way ANOVA方法进行方差分析，同时采用LSD法进行多重比较。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
由表3可知，棉粕经枯草芽孢杆菌-1、酿酒酵母和复合菌发酵后，常规营养成分均有不同程度的变化；I组的DM、CP和Ash含量极显著高于其他各组(P<0.01)；对照组的EE含量极显著高于其他各组(P<0.01)；Ⅲ组的ADF极显著低于其他各组(P<0.01)，各组之间NDF含量差异不显著(P>0.05)，与对照组相比，发酵棉粕组NDF含量分别降低了11.80％、5.23％、1.36％；各发酵棉粕组的Ca和P含量均有所提高，其中，Ⅲ组Ca和P含量显著高于对照组(P<0.05)，而与I和Ⅱ组差异不显著(P>0.05)。
由表4可知，枯草芽孢杆菌-1发酵棉粕可降低棉籽粕中丝氨酸含量，同时提高天冬氨酸、胱氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸含量。酿酒酵母和复合菌发酵棉籽粕均可降低棉粕中胱氨酸、丝氨酸、酪氨酸和蛋氨酸含量，同时提高天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、组氨酸含量。复合菌发酵棉粕中脯氨酸和丙苯氨酸含量较高。
由表5可知，与对照组相比，各试验组发酵棉粕酸溶蛋白质含量、棉籽肽含量均极显著提高(P
由表6可知，对照组的蛋白分子质量较大，分子质量>1000u的占23.4l％，l000u以下的占76.59％。而通过枯草芽孢杆菌-1、酿酒酵母和复合菌发酵之后，棉粕中大分子蛋白明显被降解为小分子蛋白、游离氨基酸和棉籽肽。与对照组相比，各发酵试验组1000u以下的棉籽肽峰面积百分比分均有提高，分别为89.41％、77.61％和84.58％。
在发酵初期，物料黏度小，通过晃动和浅层供应氧气，好氧菌得以快速生长并产酶，在发酵后期，物料黏度增大，晃动难度加大，发酵物料间氧气耗尽，进行无氧发酵。枯草芽孢杆菌-1在发酵过程中会产生CO2，在发酵后期进行无氧发酵，最终产物黏度大，成块严重，且有浓郁的枯草腐败味。酿酒酵母在发酵过程中产生CO2、酒精和水，发酵产物气味香甜。因此采用复合菌发酵可改变单一使用枯草芽孢杆菌-1发酵的气味，从而提高棉粕的应用效果。
在常规营养成分中，CP、EE和粗纤维是评定棉粕质量的几个重要指标。金红春等、鲍振国及孙焕林等通过研究复合芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌发酵棉粕发现，发酵后CP含量均显著提高。本试验中，枯草芽孢杆菌发酵极显著提高了棉粕的CP含量，一方面可能是由于微生物在发酵过程中会向胞外分泌多肽和酶蛋白等物质，且大量生长繁殖使菌体蛋白增多，因而提高了CP的含量，另一方面可能是由于发酵消耗了碳水化合物等物质，导致发酵产物的总质量减少，从而CP含量显著提高。研究发现，利用由乳酸菌与酵母菌等主要有益菌组成的复合菌发酵棉籽壳，可使NDF和ADF含量降低。本试验结果表明，发酵棉粕中ADF、NDF、EE的含量降低，这主要是由于微生物在生长繁殖的过程中能够分泌纤维素酶和脂肪酶，并且利用这些纤维素酶分解纤维素、半纤维素和木质素，将其转化为寡糖，使粗纤维含量降低，同时脂肪酶分解EE，使EE含量也降低；发酵后棉粕DM和Ash含量提高，可能与发酵底物中加人7％糖蜜有关，也可能与糖和脂类等有机物在发酵过程中消耗而引起矿物质累积有关：微生物在生长代谢过程中消耗能量，使能量物质减少，Ca和P在干物质中的比例就相对提高。
发酵饲料中氨基酸含量的高低是蛋白质饲料品质好坏的一个重要指标。在本试验中，各试验组总游离氨基酸均比对照组有大幅提高，说明微生物发酵可以将棉粕中大分子蛋白降解为小分子蛋白及游离氨基酸，从而提高棉粕中总游离氨基酸的含量。研究发现，以复合芽孢杆菌固态发酵棉粕，发酵后总游离氨基酸提高了9.98％。王晓玲等利用枯草芽孢杆菌ST-141与酿酒酵母N5对棉粕进行混合菌固态发酵，结果发现，氨基酸总量上升22.2％，必需氨基酸含量增加28.4％。刘俊等以混合菌发酵棉粕发现，各游离必需氨基酸含量均有较大提高，总游离必需氨基酸由0.65％提高到了24.00％。吴伟伟等利用黑曲霉和酿酒酵母混合固态发酵棉籽饼粕，结果表明，17种游离氨基酸总量较发酵前增加了30.10％，必需氨基酸中赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸分别较发酵前提高了31.03％、25.00％和44.23％。综上所述，微生物发酵可以使棉粕中总游离氨基酸含量更加丰富，有效改良棉粕的品质，提高其营养价值。
食品国家标准《大豆肽粉GBT 22492》2008版将小肽的标准由<10ku降低到<5ku。其检测原理：高分子蛋白质在酸性条件下易被沉淀，相对分子质量较小的蛋白质水解物(酸溶蛋白质)可溶于酸性溶解液(其中包含肽及游离氨基酸)。样品经酸化后，滤液中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量即为肽含量。常磊及亓秀晔等研究了枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和植物乳酸菌复合菌发酵棉粕的效果，结果表明，酸溶蛋白质含量分别达到了22.49％和23.54％。卜小丽等以枯草芽孢杆菌与酵母菌(2：1)混合菌发酵棉粕，小肽含量为11.13％，较发酵前提高了20.19％。李全丰对比了植物乳杆菌、产阮假丝酵母菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉4株菌在生料固态发酵棉籽蛋白粉制备小肽中的差异，结果发现，植物乳杆菌可以使发酵棉籽蛋白粉中小肽含量从0.41％增加到5.36％。刘俊等通过单菌及组合菌发酵发现，最适菌种组合为B．Subtilis(H1)和A．niger(P1)。两菌株复合发酵后，小分子多肽含量提高了11％。吴胜华等利用两种芽孢杆菌加上乳酸菌和酵母菌，采用固态发酵制备小肽，小肽总含量由1.6l％提高到12.01％(DM基础)。刘建成研究表明，在优化的最佳发酵条件下，棉粕寡肽的生产量可达32.13％。本试验最终结果显示，枯草芽孢杆菌-1发酵、酿酒酵母发酵和复合菌发酵后棉籽肽含量分别由发酵前韵3.21％提高到发酵后的27.19％、15.84％和20.34％，说明枯草芽孢杆菌-1降解棉粕大分子蛋白为棉籽肽效果最好。以上研究结果表明，微生物发酵棉粕可以更好地将大分子蛋白质降解为小分子棉籽肽。
在现有的小肽分子质量分布检测方法中，最准确的可以测定出小肽含量和小肽分布情况的是利用高效液相色谱测定。本试验结果显示，棉粕原料的蛋白质分子质量较大，分子质量在1000u以上的占23.41％，1000u以下的占76.59％。而通过枯草芽孢杆菌-1、酿酒酵母发酵和复合菌发酵之后，1000u以上和1000u以下的峰面积百分比分别为10.6％、22.39％、15.42％和89.41％、77.61％、84.58％，据此推测，微生物发酵过程中产生的酶类可将棉粕中大分子蛋白质降解为小分子棉籽肽和游离氨基酸。刘俊筛选得到了改良棉粕蛋白质价值效果较好的4株菌混合物，利用其发酵后，平均分子质量在66ku附近的棉粕蛋白质被降解至14ku 以下。孙焕林等对枯草芽孢杆菌发酵棉粕的营养特性进行研究，结果显示：分子质量为
在本试验中，枯草芽孢杆菌-1发酵棉粕CP、DM、总游离氨基酸、酸溶蛋白质及棉籽肽的含量显著提高，同时可有效将棉粕中大分子蛋白降解为小分子多肽和游离氨基酸，然而其发酵产物硬度大，难以粉碎，有很浓郁的枯草腐败味。枯草芽孢杆菌-1和酿酒酵母复合菌发酵显著提高了棉粕中Ca、P、DM、Ash、总游离氨基酸、酸溶蛋白质及棉籽肽含量，降低了EE和ADF含量，发酵产物有浓郁的酒香味，在一定程度上提高了其适口性。从发酵棉粕的适口性来说，复合菌发酵优于枯草芽孢杆菌-1和酿酒酵母单独发酵，从发酵棉粕营养价值来说，枯草芽孢杆菌-1发酵优于复合菌和酿酒酵母发酵。
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