无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜形态和杯状细胞 的影响
摘 要：本试验旨在研究无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜形态和杯状细胞的影响。试验选取遗传背景相似的初生健康乳猪 120 头，随 机分为试验组和对照组，每组 6 个重复，每个重复 10 头猪。对照组饲喂含抗生素的基础饲粮，试验组饲喂以 10% 发酵饲粮代替部分 无抗生素基础饲粮的试验饲粮，营养和能量水平调到与对照组相当。结果表明：1）试验组和对照组在小肠黏膜形态上有一定的差异。 2）在 44日龄时，试验组空肠绒毛高度比对照组提高 7.19%（P ＜0.05）。在 44和 75日龄时，试验组回肠绒毛高度显著高于对照组（ P ＜ 0.05）。 3）对照组十二指肠、空肠、回肠隐窝深度均高于试验组，但差异不显著（P ＞ 0.05）。4）在 44 日龄时，试验组回肠 绒毛高度 / 隐窝深度（V/C）比对照组提高 17.18%（P ＜ 0.01）。5）在 44 日龄时，对照组十二指肠、空肠和回肠黏膜上皮间杯状细 胞数量极显著高于试验组（P ＜ 0.01）。在 75 日龄时，对照组十二指肠黏膜上皮间杯状细胞数量极显著高于试验组（P ＜ 0.01）。 综上所述，无抗发酵饲粮能改善小肠黏膜形态，增大吸收面积，从而促进小肠对营养物质的吸收。
关键词：无抗发酵饲粮；猪；小肠黏膜；杯状细胞
抗生素在饲粮中的广泛使用，造成细菌耐药性、食品安全、 公共卫生和环境污染等问题，农业部农办医 [2018]13 号明确指 出 2020 年药物饲料添加剂全部退出，饲粮中禁止添加抗生素。 因此，研发安全、无残留、能有效替代抗生素的新型饲料添加 剂已成为发展趋势。由于益生菌发酵饲粮通过 1 种或多种益生 菌的发酵，饲粮中富含更多的活性益生菌菌体、有益代谢产物， 同时可消除饲粮中的抗营养因子，能够促生长和维持动物健康， 而益生菌是替代抗生素潜力最大的一种添加剂。在动物机体中， 小肠是营养物质消化吸收的主要场所，小肠黏膜状态与营养物 质的吸收密切相关，肠道杯状细胞是一种分泌细胞，其分泌的 黏蛋白（MUC）和三叶肽因子等形成肠道黏液层，对维持肠道黏 膜稳态起着重要的作用。本试验通过观察不同日龄猪的肠道黏 膜形态，测量小肠黏膜的绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度 / 隐窝深度（V/C）及肠绒毛上皮间杯状细胞的数量，来探讨无抗发 酵饲粮对猪肠道黏膜的影响，为其代替市场上含有抗生素的饲 粮提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验动物及设计
选取 120 头体重相近的 “长 × 大”初生健康乳猪，随机 分为试验组和对照组，每组 6 个重复，每个重复 10 头猪，试验 分为 3 个阶段即哺乳阶段（0 ～ 28 日龄）、断奶阶段（29 ～ 44 日龄）、保育阶段（45 ～ 75 日龄），试验周期共 75d。各组试 验仔猪以窝为单位，7 ～ 28 日龄饲喂哺乳仔猪饲粮，29 日龄转 群至保育舍，饲喂断奶仔猪饲粮至试验结束。对照组和试验组 同舍饲养，各重复室内均匀分布，条件尽可能一致，自由采食，自主饮水。
1.2 试验饲粮
无抗发酵饲粮的生产方式为：将玉米与豆粕按各 50% 的比 例进行称量、粉碎和混合，作为发酵底物；发酵菌种由鼠李糖 乳杆菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酵母菌 组成，料水比为 1.00 ∶ 0.45；35℃ 厌氧发酵 60h，委托新乡市酵守康饲料有限公司生产。试验组饲粮加入以 10% 发酵饲粮来 替代部分不含抗生素基础饲粮，对照组饲喂含抗生素的基础饲 粮 （50mg/kg 金霉素和 100mg/kg 吉他霉素），并调整试验组各 阶段的饲粮营养水平与对照组相同。玉米－豆粕型混合饲粮发 酵前后营养水平见表 1。哺乳仔猪和断奶仔猪基础饲粮组成及 营养水平分别见表 2、表 3。
1.3 样品采集与处理
在仔猪出生后的第 5、15、25、44 和 75 分别于 2 组的每个 重复中随机抽取 1 头猪称重后宰杀，取十二指肠、空肠和回肠 各段约 2cm，于 4% 多聚甲醛液中固定。
1.4 组织切片制作
样品在 4% 多聚甲醛溶液中固定 48h 后，将组织修整成 7mm 小块；自来水冲洗固定 12h；常规梯度酒精脱水、透明、石蜡 包埋后切片，进行苏木精－伊红（HE）染色和高碘酸雪夫氏（PAS）染色。
1.5 肠黏膜检测指标
在各阶段的十二指肠、空肠和回肠每个样本中选取 5 张切 片，低倍镜下每张切片选出 5 个不同视野观察肠黏膜形态，测 量绒毛高度、隐窝深度、V/C 和杯状细胞数量。观察过程中应 注意所选取的肠绒毛长度应该基本一致，应用 Nikon50i 显微镜 照相处理软件进行拍照。
1.6 统计分析
试验数据用平均值 ± 标准差表示，采用 SPSS 19.0 软件进 行 t 检验分析，以P ＜ 0.05 表示差异显著，以P ＜ 0.01 表示 差异极显著。
2 结果与分析
2.1 无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜形态的影响
试验组和对照组小肠黏膜形态变化上有一定的差异。由图 1 可见，2 组十二指肠不同的变化表现为：试验组肠绒毛较长， 呈明显的叶状结构，绒毛的游离端明显膨大。绒毛体至腺体部 散在少量杯状细胞，肠腺中的杯状细胞增多。肠绒毛的固有层 中有较多散在的淋巴细胞。而对照组肠绒毛较短，呈指状，绒 毛的游离缘有较多的杯状细胞分散在柱状细胞之间。2 组猪空 肠不同的变化表现为：试验组肠绒毛较粗，固有层发达，其中 弥散大量淋巴细胞，肠腺部的固有层也有大量淋巴细胞，形成 淋巴组织样结构。对照组肠绒毛较细，固有层不发达，肠腺部 固有层内淋巴细胞较少，呈散在状，没有形成淋巴组织样结构。 2 组回肠不同的变化表现为：试验组回肠绒毛较稀疏，绒毛的 固有层较发达，其中分布大量淋巴细胞。肠腺基部的固有层中 有大量淋巴细胞集聚，并突破黏膜肌层，在固有层和黏膜下层 形成集合淋巴小结样构造。对照组回肠绒毛细长，数量较多， 排列较密。 在黏膜下层中见有淋巴小结形成，呈现孤立淋巴小 结样构造。
2.2 无抗发酵饲粮对猪小肠绒毛高度的影响
如表 4 所示，自 25 日龄开始，试验组十二指肠绒毛高度整 体都略高于对照组，但没有达到差异显著的水平（P ＞ 0.05）。 在 44 日龄时，试验组空肠绒毛高度比对照组提高 7.19 %（P ＜ 0.05），其他日龄组间差异不显著（P ＞ 0.05）。在 44 和 75 日龄时，试验组回肠绒毛高度显著高于对照组（P ＜ 0.05）， 其他日龄组间差异不显著（P ＞ 0.05） 。
2.3 无抗发酵饲粮对猪小肠隐窝深度的影响
如表 5 所示，对照组十二指肠、空肠、回肠隐窝深度均较 高于试验组，但差异不显著（P ＞ 0.05）。在 75 日龄时，试验 组十二指肠和回肠隐窝深度比对照组分别降低 6.40% 和 5.98%， 但差异不显著（P ＞ 0.05） 。
2.4 无抗发酵饲粮对猪小肠 V/C 的影响
如表 6 所示，试验组十二指肠、空肠和回肠 V/C（除 15 日 龄十二指肠外）均高于对照组，但差异不显著（P ＞ 0.05）。 其中在 44 日龄时，试验组回肠 V/C 比对照组提高 17.18%，差异 极显著（P ＜ 0.01） 。
2.5 无抗发酵饲粮对猪小肠黏膜上皮间杯状细胞数量的 影响
小肠黏膜上皮的杯状细胞分散在柱状细胞之间，但也有连 续排列的杯状细胞，一般靠近肠腺部位较为集中，胞核位于基 底部，呈高脚杯状，被 PAS 染色法染成深红色（图 2）。在 25 日龄时，试验组和对照组十二指肠绒毛体的中、下两侧部至肠 腺部见有较多的杯状细胞，绒毛顶端的杯状细胞较少，杯状细 胞分泌的黏液被染成深红色覆盖在肠上皮表面，以对照组较显 （图 2-A、图 2-B）。在 75 日龄时，试验组空肠肠绒毛变短， 但较粗，排列较密集。杯状细胞多分散于肠绒毛体两侧的吸收 细胞间，绒毛顶端少有杯状细胞（图 2-C）。对照组空肠绒毛较 粗大，呈叶状。 在绒毛两侧的吸收细胞之间杯状细胞数量增多， 有的呈连续排列，肠腺部杯状细胞较为集中（图 2-D）。在 75 日龄时，回肠绒毛变短，较粗，绒毛的固有层中有大量淋巴细胞，绒毛顶端有肠上皮脱落现象（图 2-E、图 2-F）。试验组肠 绒毛呈锥状，绒毛的两侧到肠腺部见有大量杯状细胞，肠腺腔 的上皮细胞也被 PAS 染成深红色（图 2-E）。对照组回肠绒毛呈 短柱状，较稀疏，绒毛的中、下部和肠腺部有较多的杯状细胞， 至绒毛顶端脱落（图 2-F）。
如表 7 所示，在 44 日龄时，对照组十二指肠、空肠和回肠
黏膜上皮间杯状细胞数量极显著高于试验组（P ＜ 0.01）。在
75 日龄时，对照组十二指肠黏膜上皮间杯状细胞数量极显著高
于试验组（P ＜ 0.01）。其他日龄组间差异不显著（P ＞ 0.05）。
3 讨 论
小肠是猪对营养物质消化和吸收的主要场所，其功能的发 挥与其生理结构是密切相关的，肠道屏障功能可以维持微生态 的平衡，所以肠道黏膜与动物的健康至关重要，特别是小肠绒 毛高度、隐窝深度、V/C 及有效的吸收面积都是衡量其消化和 吸收功能高低的重要指标，肠道形态学结构的改变是造成消化 吸收功能和免疫功能差异的主要原因之一。肠绒毛和微绒毛的 存在极大地增加了小肠与食物的接触表面积，肠绒毛变短时， 肠上皮细胞数量随之减少，其营养物质吸收能力降低。绒毛根 部下陷至固有层形成的管形缩陷为小肠腺即隐窝，当肠道绒毛 脱落，隐窝多能干细胞会分化成新的肠上皮细胞向绒毛顶端移行，形成新的绒毛。隐窝深度反映细胞的生成率，隐窝变浅表 明细胞成熟率上升，分泌功能增强。V/C 下降表明小肠的消化 吸收功能下降，比值升高表明消化吸收率增强。庞敏等研究表 明，断奶应激对仔猪的肠道黏膜形态有很大的影响，而饲喂益 生菌发酵饲粮可以显著提高断奶仔猪的肠道上皮绒毛高度，且 显著提高 V/C。断奶应激会造成仔猪的绒毛萎缩，隐窝细胞分裂 过快，造成隐窝深度增加及 V/C 下降，严重影响小肠对营养物 质的消化吸收。益生菌发酵饲粮可以提高饲粮中有机酸含量， 降低 pH，进而使断奶仔猪胃液 pH 与消化道酸度发育水平趋于稳 定，减少仔猪腹泻和增强仔猪对营养物质的消化吸收能力。益 生菌发酵为减少断奶仔猪应激提供了一种营养策略。邓军研究 表明，同时饲喂枯草芽孢杆菌和猪源乳酸杆菌可以提高十二指 肠和空肠的绒毛高度和降低空肠和回肠的隐窝深度，V/C 升高。 Feng 等研究发现，饲喂发酵豆粕配合饲料可以显著提高断奶仔 猪小肠绒毛高度，提高 V/C。
本试验结果显示，在 44 日龄时，试验组空肠和回肠绒毛高 度显著高于对照组；在 75 龄时，试验组回肠绒毛高度显著高于 对照组；在 44 日龄时，试验组回肠 V/C 显著高于对照组。根据 本试验结果得出：试验组绒毛高度、隐窝深度和 V/C 略优于对 照组。 其原因可能是饲粮经过益生菌发酵后，其营养成分更有 益于动物机体的吸收，几种益生菌复合发酵后随着饲粮一同进 入消化道，黏附于肠道黏膜上皮细胞，并在动物胃肠道中迅速 萌发和增殖，调节胃肠道微生物生态平衡，且发酵产物中的有 机酸、氨基酸和小肽等代谢产物能刺激肠绒毛的生长发育和肠 上皮细胞的更新，增加绒毛高度，提高 V/C，进而促进小肠对饲 粮中营养物质的消化吸收。此外，益生菌还能调节肠道黏液的 分泌，上调肠道上皮细胞紧密连接蛋白和细胞骨架蛋白的表达， 增强肠上皮细胞间的紧密连接，维持肠道黏膜屏障的完整性。 小肠杯状细胞起初分化于小肠腺，之后向绒毛顶端或肠上皮不 断迁移分化，最后脱落至肠腔死亡，为杯状细胞的一个分泌周期。 杯状细胞是一种典型的黏液细胞，其成分主要是黏蛋白，黏蛋 白颗粒分泌到胞外与水、无机盐等合成黏液附着在肠黏膜表面 形成肠道黏液层，有润滑保护作用，并参与多种肠道疾病的发 生发展。但肠绒毛杯状细胞数量增多，分泌过量的黏液覆盖在 肠黏膜表面，会使消化酶的分泌减少，肠黏膜的吸收面积减少， 再加之大量黏液被覆在肠上皮细胞的表面，在肠上皮细胞与肠 内容物之间形成了一道屏障，减少了肠上皮细胞与营养物质接 触的机会，故在很大程度上降低了肠道的吸收面积，导致营养 物质的吸收障碍，严重时可引起腹泻。张献彩发现发生糖尿病小鼠的小肠绒毛易被破坏，糖尿病组中杯状细胞的分泌物比同 月份正常对照组显著增加。本试验结果显示，在 44 日龄时，对 照组十二指肠、空肠和回肠杯状细胞数量极显著高于试验组； 在 75日龄时，对照组十二指肠杯状细胞数量极显著高于试验组。 分析原因可能是饲喂抗生素饲粮的对照组猪在断奶后，由于受 到断奶应激的影响，肠道黏膜受损，破坏小肠绒毛，引起炎症 反应，使缓激肽和组织胺释放增多，这些刺激可直接引起杯状 细胞分泌增多，而无抗发酵饲粮中的益生菌能与黏蛋白一起作 为肠道黏膜屏障，阻碍致病菌进入体内，并能调节杯状细胞的 产生和肠液中黏蛋白的含量，使肠道中杯状细胞的数量趋于稳 定，维持肠道结构的完整。此外，发酵产物中的一些小分子有 益代谢产物能自由通过黏液层，更有利于机体的吸收。
4 结 论
综上所述，饲喂无抗发酵饲粮在哺乳、断奶和保育阶段对 猪机体无不良影响，并可在一定程度上改善肠道黏膜形态，提 示无抗发酵饲粮可以替代含抗生素的饲粮应用于猪生产中。
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