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菌酶协同处理豆粕制备饲用小肽的研究

2021-05-18 15:01:25      点击:

摘要:以小肽含量为指标研究了芽孢杆菌、酵母菌和中性蛋白酶协同发酵、酶解处理豆粕制备饲用小肽的工艺条件。

结果表明:菌酶协同处理豆粕的最佳条件为混合菌接种量1.5%、加酶量450 U/g、料水比1:1.4、发酵温度40℃、发酵时间48h。在此条件下,豆粕经菌酶协同处理后,小肽含量从11.40mg/g提高到199.65mg/g粗蛋白质含量从47.62%提高到56.72%。

传统营养理论认为,蛋白质必须被消化成游离氨基酸之后才可被消化道吸收利用,蛋白质营养即是氨基酸营养。而新的研究表明,蛋白质经消化道酶降解成游离氨基酸和各种小肽后。小肽以完整的形式和游离氨基酸同时被动物直接吸收利用(陈培赛和薛成君,2008;Backwell,1997b)。小肽是指由多个氨基酸残基组成的具有多种生物功能的肽(崔艳红,2009)。小肽在动物机体内的作用主要有传递神经息、促进胃肠道消化功能、强化养分与吸收、调控物质代谢、参与机体的免疫调节等(Boze,2000;Backwell,1997a)。豆粕是一种优质的饲用蛋白原料,具有较高的蛋白质含量,其氨基酸组成也较平衡,是一种潜在的优质小肽资源(Adetayo,2005),传统的豆粕发酵主要是利用微生物的作用降低豆粕中的抗营养因子,或利用蛋白酶水解豆粕制备大豆肽,而采用微生物发酵和酶解协同作用处理豆粕。更有效地提高豆粕小肽化程度的报道较少(Lee,2005)。

本研究采用芽孢杆菌、酵母菌和中性蛋白酶混合处理豆粕,并优化菌酶协同处理豆粕工艺,以期获得小肽化程度更高的饲用肽,进而提高豆粕的利用率与蛋白质品质。

材料与方法

1 材料

豆粕:浙江某生物科技有限公司提供,去皮豆粕,粗蛋白质≥45%。

菌种:BSW一2为枯草芽孢杆菌(Bacillussub.tilis),YT为酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisi.ate),均为本实验室保藏菌株。

中性蛋白酶:购于上海某生物科技有限公司,酶活≥50U/g;

酶活定义:在(40±0.2)℃,pH7.0条件下,1min内水解酪蛋白底物,产生相当于1μg酚类化合物(由酪氨酸等同物表示)所需的酶量,定义为1个酶活单位,以u/g表示(DB33/T 459-2003)。

2 培养基

PDA培养基:马铃薯(去皮)200g、蔗糖(或葡萄糖)20g、水1000mL、pH值自然;LB培养基:蛋白栋10g、酵母粉5g、氯化钠10g、水1000 mL、pH7.0。

3 方法

3.1 液体种子的制备

枯草芽孢杆菌经斜面活化后刮取一环接人20mL液体LB培养基,在30℃,160r/min条件下摇瓶培养12h,制成种子液:酵母菌经斜面活化后刮取一环接入20mL液体PDA培养基,在30℃,160r/min条件下摇瓶培养18h。制成种子液。

3.2 豆粕发酵方法

豆粕基础菌酶协同处理条件为装料量100g/瓶、中性蛋白酶添加量400u/g、BSW-2和YT接种量各1%、料水比1:1、发酵温度30℃、发酵时间48h基础上,豆粕以一定比例加水,接种,加酶,混合均匀后装入罐头瓶中,用8层纱布加报纸封口,放入培养箱中,设定温度,在实验选取的时间取出,50℃烘干,粉碎,过80目筛待测。

3.3 豆粕菌酶混合发酵单因素试验

3.3.1 接种量对小肽含量的影响

在基础发酵条件上。控制其他因素不变,分别接种0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的BSW-2和YT混合菌液(比例为1:1)进行发酵,发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽含量。

3.3.2 加酶量对小肽含量的影响

在基础发酵条件上,控制其他因素不变,分别添加0、100、150、200、250、300、350、400、450、500U/g中性蛋白酶进行发酵,发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽含量。

3.3.3 料水比对小肽含量的影响

在基础发酵条件上,控制其他因素不变,分别按料水比1:0.6、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8加水进行发酵,发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽含量。

3.3.4 处理温度对小肽含量的影响

在基础发酵条件上,控制其他因素不变,分别设定30、35、40、45、50℃的温度进行发酵,发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽含量。

3.3.5 处理时间对小肽含量的影响

在基础发酵条件上。控制其他因素不变,分别设定0、12、24、36、48、60、72h的时间进行发酵,发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽含量。

3.4 菌酶协同处理工艺优化

根据单因素试验结果,设计5因素4水平L16(45)的正交试验进行发酵工艺优化。发酵结束经烘干、粉碎后测定小肽、粗蛋白质含量和进行聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(SDS—PAGE)。

3.5 发酵样品小肽含量的测定

将待测样品过80目筛,等体积加入10%三氯乙酸(TCA),在160r/min摇床中30 min。然后4000r/min离心15min。取上清液做适当稀释后用改良Lowry法测定蛋白质总量(张康,2001;GB/T 22492—2008)。

3.6 发酵样品粗蛋白质含量的测定

采用凯氏定氮法,参照GB/T 14771食品中蛋白质的测定方法(GB/T 14771)。

3.7 发酵样品蛋白质降解度的检测

发酵样品蛋白质降解度的检测采用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳法,(SDS—PAGE)。

结果与分析

1 豆粕菌酶混合发酵工艺的研究

1.1 接种量对小肽含量的影响

由图1结果可知:小肽含量随着接种量的增加,说明BSW一2+YT发酵可以使小肽含量得到提高。当接种量为2.5%时,豆粕发酵后小肽含量最高,为185.16mg/g。

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1.3 料水比对小肽含量的影响

料水比是影响固体发酵的重要因素之一。水分含量影响发酵过程中微生物的生长。同时对酶的作用影响也比较大。由图3的结果可知,小肽的含量随着料水比的增加,呈现先增大后减小的趋势,当料水比为1:1.2时,小肽含量最高,为194.90mg/g。当料水比过大时,小肽含量呈现减少的趋势,可能是由于芽孢杆菌这类好氧菌在水分过多时生长受到抑制,从而影响了蛋白质降解成小肽。

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1.4 发酵温度对小肽含量的影响

温度是影响酶活的重要因素,酶活的高低,直接影响到豆粕中蛋白质酶解成小肽。由图4的结果可知,小肽含量随温度的升高,先增加后减少,当发酵温度为40℃时,小肽含量最高,为192.73mg/g。

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1.5 发酵时间对小肽含量的影响

由图5的结果可知:随着发酵时间的延长,小肽的含量先上升后略有下降,当发酵时间为48h时,小肽含量最高为182.43mg/g。当发酵时间长于48h,随着酶解时间的延长,小肽被进一步酶解生成游离氨基酸,含量反而出现下降趋势,因此酶解时间不宜过长。

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2 豆粕菌酶混合发酵工艺优化

在单因素试验的基础上,得到各因素的适宜水平后,设计5因素4水平L16(45)的正交试验进行发酵工艺优化,试验因素水平编码表、试验设计及实施方案和结果见表1、表2。

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2.1 正交试验结果的直观分析

从表2直观分析可以看出,极差列中接种量因素的极差值最大,所以得出结论接种量因素对小肽含量的影响最大,其次是发酵温度、料水比、发酵时间、发加酶量。发酵最优条件为A1B3C2D4E3,即接种量1.5%,加酶量450u/g,料水比1:1.4,温度40℃,时间60h。

2.2 发酵方案的确定

从正交表中观察得知最优组合为A1B3C3D3E3,与理论最优条件A1B3C2D4E3对比可知发酵时间不同,结合单因素试验结果,发酵时间过长小肽含量反而有所下降,因此对这两种方案进行3次验证试验,测得小肽含量与粗蛋白质含量见表3。

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由表3可知,理论最优条件没有正交表中最优组合结果好,因此最优条件为A1B3C3D3E3,即接种量1.5%,加酶量450u/g,料水比1:1.4,温度40℃,时间48h,发酵结束后小肽含量从11.40mg/g提高到199.65mg/g;粗蛋白质从47.62%提高到56.72%。

2.3 SDS—PAGE电泳检测蛋白降解程度

将最终确定的发酵工艺的发酵产品进行SDS—PAGE检测,以原料豆粕做对照,结果见图6。图6结果显示,与原豆粕相比,发酵产品中的大分子蛋白得到有效降解,生成小分子的多肽、小肽和氨基酸,其蛋白质的分子质量在45kDa以下,小于14.4kDa的占很大一部份,由此可见,发酵后豆粕的品质得到了有效提升。

讨论

小肽的制备主要采用微生物发酵法和酶解法。从本质上讲,微生物发酵法和酶解法都是利用蛋白酶的酶解作用。微生物发酵法生产小肽的工艺主要有固体发酵和液体发酵。微生物固体发酵的优点是能较好地去除豆粕中的抗营养因子。发酵过程中加入的微生物如乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等,其本身就是益生菌,有利于改善动物胃肠道的微生态环境,减少抗生素的应用和疾病的发生。本研究采用的是芽孢杆菌和酵母菌混合发酵豆粕,芽孢杆菌相对于霉菌来讲,生长速度较快,发酵周期较短,降低了生产成本,并且在发酵过程中分泌蛋白酶,利用蛋白酶的内切作用将蛋白质降解成低分子质量的肽,因此对豆粕蛋白有较好的降解作用;酵母菌在发酵过程中产生酒香味,使发酵产品的风味有所提升,同时酵母本身也是很好的菌体蛋白,使豆粕发酵后的粗蛋白质提高。

目前酶解法制备小肽。主要采用中性蛋白酶、碱性蛋白酶和酸性蛋白酶(刘通讯,2002)。万琦(2003),刘大川和钟方旭(1996)研究了5种蛋白酶:中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶的特性,筛选出碱性蛋白酶水解大豆蛋白制大豆肽,水解效果虽然较好,但是产物带有强烈的苦味,需要采取一定的脱苦工艺后方可使用。王之盛和况应谷(2004)的研究结果表明,在碱性条件下有利于豆粕抗原蛋白的降解,中碱性条件有利于7S和2S小分子质量抗原蛋白的进一步降解。本研究采用中性蛋白酶酶解豆粕,相对于碱性蛋白酶和酸性蛋白酶,避免固体发酵pH调节困难的问题,使发酵方式更为简单有效。

菌酶混合协同处理法生产小肽,充分利用微生物发酵与酶解各自的优势。发挥微生物与蛋白酶的协同作用使豆粕蛋白降解更充分,小肽化程度更高,同时避免了酶解产品的苦味,提高产品风味及适口性,进一步改善了豆粕饲用肽产品品质和营养价值。这对实现饲用肽的工业化生产具有重要的参考价值。

结论

以豆粕为原料,利用芽孢杆菌、酵母菌、中性蛋白酶混合发酵豆粕生产小肽饲料。在接种量1.5%、加酶量450U/g、料水比1:1.4、发酵温度40℃、发酵时间48h条件下。豆粕发酵后,小肽含量和粗蛋白含质量都有显著提高,小肽含量从11.40mg/g提高到199.65mg/g;粗蛋白质从47.62提高到56.72%。

实战操作技术——棉菜籽饼脱毒变身优质饲料替代豆粕操作新技术

当前豆粕价格很高有些地方货源紧缺,而棉菜籽饼(棉籽粕、菜籽粕)价格相对便宜,棉菜籽饼是棉子、油菜籽榨油后剩下的饼状残渣,蛋白质含量较高,含有各种氨基酸成分。但由于棉菜籽饼中含有植酸、芥子碱等物质,这些物质含有一定的毒性,还会影响动物的消化吸收,不能大量使用,因此不建议直接饲喂给动物!

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现在通过微生物饲料发酵剂的除毒脱毒技术,可以成功将菜籽饼变为优质添加饲料,直接按照1公斤发酵的棉菜籽饼(发酵前的重量)代替约0.85公斤豆粕进行使用。饲料发酵剂中的有益微生物,在发酵过程中分泌的代谢产物,可将棉菜籽饼中的毒性物质等有效分解。

豆粕、菜粕、棉粕成分对比

1.豆粕是一种高蛋白原料,无需脱毒即可用作饲料。其中蛋白质含量为40%-48%,赖氨酸含量为2.5%-3.0%,色氨酸含量为0.6%-0.7%,蛋氨酸含量为0.5%-0.7%。2020年11月12日报价每吨在3500元左右。

2.菜粕的粗蛋白含量在34%-38%之间,特点是蛋氨酸含量高(仅次于芝麻饼、粕),赖氨酸含量亦高。而精氨酸含量低,是饼、粕饲料中含量最低的。菜籽粕的有效能值偏低(淀粉含量低、菜籽壳难以消化利用)。矿物质中,钙和磷的含量均高,硒和锰的含量亦高。特别是硒的含量是常用植物饲料中最高的。2020年11月12日报价每吨在2900元左右。

3.棉粕蛋白质含量一般为44.32%,仅次于豆粕的蛋白质含量48%,而高于菜籽粕的蛋白质含量36.04%。精氨酸含量高达3.6%-3.8%,而赖氨酸含量仅有1.3%-l.5%,只有豆粕的一半。2020年11月12日报价每吨在3000元左右。

是否需要脱毒处理

1.豆粕无需经过脱毒即可用作饲料。而且豆粕中富含蛋白质和多种氨基酸,在不需要额外加入动物性蛋白的情况下,仅豆粕中含有的蛋白质和氨基酸足以平衡家禽和猪的食谱,促进它们的营养吸收。只有当其他粕类单位蛋白成本远低于豆粕时,豆粕才有可能被替代。

2.菜粕菜籽中含有硫葡萄糖苷、芥酸、单宁、皂角苷等不良成分,其中主要是硫葡萄糖苷。硫葡萄糖苷本身无毒,但在一定温度和水分条件下,经过菜籽本身含有的芥子酶的酶解作用而产生异硫氰酸酯、唑烷硫酮和腈类等有害物质。这些物质可引起甲状腺肿大,从而造成动物生长速度下降,繁殖力减退。单宁则妨碍蛋白质的消化,降低适口性。而芥酸阻挠脂肪代谢,造成心脏脂肪蓄积及生长受到抑制。。使用前需进行一定的脱毒处理,并且使用时要加以限制,具体喂量应根据菜粕中有害成分含量而定。经过脱毒处理的菜籽粕喂量可以加大,而“双低”油菜籽生产的菜粕喂量要受限制。同时,应结合菜粕的氨基酸组成特点,适当搭配其它饼粕。

3.棉籽中含有对动物有害的棉酚及环丙烯脂肪酸,尤其是棉酚的危害很大。在制油过程中,由于蒸炒,压榨等热作用,大部分棉酚与蛋白质、氨基酸结合而变成结合棉酚,结合棉酚在动物消化道内不被动物吸收,故毒性很小。另一部分棉酚则以游离形式存在于饼、粕及油品中,这部分游离棉酚对动物毒性较大,尤其单胃动物过量摄取或摄取时间较长,可导致生长迟缓、繁殖性能及生产性能下降,甚至导致死亡。幼小动物对棉酚的耐受能力更低。由于棉籽饼、粕中游离棉酚对动物有害,因此,在使用棉饼、粕时,要根据饲喂对象及饼粕中游离棉酚的含量加以限量。反刍家畜在有优质粗料及多汁青料的情况下,棉籽饼、粕的用量不受限制,不会造成中毒。对单胃动物要限制喂量,最好使用经过脱毒处理的棉籽饼粕。同时,使用棉籽饼、粕配制饲粮要注意氨基酸平衡,尤其是棉籽饼、粕的赖氨酸含量低,且利用率差,应注意添加赖氨酸。

发酵操作技术

发酵棉菜籽饼其实也是一个脱毒技术,具体操作如下:

1.仔细检查棉菜籽饼,剔除棉菜籽饼中严重变质发霉的部分,轻度发霉的原料可以忽略,因为微生物发酵能够脱霉。

2.将棉菜籽饼粉碎并添加适量的玉米粉淀粉类的能量饲料等,调节饲料营养比例。

3.每吨棉菜籽饼加入2公斤食盐、玉米粉(其它淀粉、面粉次粉等也可以,或者粉碎的生红薯300公斤也可以)100公斤、“99多功能饲料发酵剂”1包(500g/包,市场售价约25元,以高浓度乳酸菌、酵母菌、复合酶制剂的专业发酵剂)。

4.在混合物料中添加适量水分,使混合物料含水量保持在55%左右,以“手抓一把并紧握,无水滴落,松手后轻触即散”为宜,一般上述配方中需要加入清水约500-600公斤。

5.发酵方式根据实际环境条件各异,在桶、缸、塑料袋等容器中发酵均可。

6.发酵时要尽可能排尽空气进行密封发酵。如果使用的发酵容器有密封不严实的隐患,要在一开始就在其外层包裹一层塑料袋并扎紧。发酵过程中不能启封。

7.发酵时间受环境温度影响,通常夏季发酵2-3天,冬季发酵5-7天即可完成。发酵完成后,有较为强烈的酸香味,ph值在3-4。

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规模运用混合发酵现场

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塑料缸、饲料袋(有内膜)均可做发酵饲料

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采用池子发酵

发酵完成的棉菜粕饲喂动物技术

需要注意的是,发酵后的饲料酸度较低,不可以取代禽畜全部日粮。其他类发酵饲料同理。饲喂时根据不同情况,将发酵饲料按照一定比例添加到日粮中,发酵完成的棉菜粕为湿料,具体使用量每大概1.5-2公斤发酵棉菜粕(湿料)代替动物日粮配方中1公斤豆粕的使用量进行代替使用,与其它饲料混合后直接饲喂,由于棉菜籽粕蛋白较高,最高使用量不要超过禽畜日粮饲喂量的40%(湿料重量)。如果发现发酵饲料过酸适口性变差,可在饲喂前在阳光下晒1-2小时,或添加适量的碳酸氢钠(小苏打)即可改善。

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发酵过程中与发酵后使用过程中,发酵的容器要一直保持密封状态,可以长时间保存(一年左右)。

当前养殖业成本高居不下,而饲料成本是其中最高的,利用廉价原料发酵饲料(包括一些轻度发霉的粕类低价收回)是极佳解决办法。通过微生物饲料发酵剂的发酵作用,可以将轻度霉变饲料变成优质饲料,将不易消化的物质分解为可被畜禽吸收的小分子糖类、氨基酸等。同时发酵饲料中富含有益微生物、酶制剂、酸化剂等,可调节畜禽肠胃微生态环境并进一步提高饲料利用率。发酵饲料气味清香,提高了饲料的适口性,加上发酵饲料中有大约4℃的酒度,能够促进动物新陈代谢促进健康抵御疾病,是当前养殖业发展中重要的一环。

本技术也可以同样发酵菜籽粕(饼)、棕榈粕等,方法同上。

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