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凝结芽孢杆菌产芽孢培养基及培养条件优化

2017-04-18 09:10:06      点击:


导读

乳酸菌是一类能够发酵利用糖产生乳酸的细菌统称。一般乳酸菌不易存活,对环境的抗逆性差,不能够耐高温,耐酸和耐胆盐,因此乳酸菌制品普遍存在着保存性差、易失活等缺点。

凝结芽孢杆菌是一类能够形成芽孢的乳酸菌,它除了具有一般乳酸菌的维持肠道微生态平衡,提高机体消化功能和健康水平外,还具有耐高温,耐酸、耐胆盐等优点,能有效抑制有害菌的生长,改良肠道微生态环境,促进肠道发育,增强肠道功能,在饲料行业有很好的应用前景,被美国食品与药物局(FDA)列入可用于饲料的安全微生物菌种名单。由于凝结芽孢杆菌的芽孢具有易保藏、复活率高等特点,因而是乳酸菌商品化制剂的重要形式。目前如何通过培养条件调控,使凝结芽孢杆菌的产芽孢率提高是研究重点。本文在前期筛选获得一株凝结芽孢杆菌B2的基础上,尝试采用液态发酵方式,通过PB试验设计优化其培养基组成及培养条件,以期进一步提高凝结芽孢杆菌的产芽孢数,为后期制剂的大规模生产提供数据依据。

1材料与方法

1.1 材料

菌种:凝结芽孢杆菌B2为本实验室筛选,于-20 ℃保存。

发酵培养基:YPD培养基,成分为葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母浸粉10 g,加水至1 L,pH值7.0,115 ℃灭菌20 min。


1.2 方法

1.2.1 菌种活化

将保存的菌种转接到种子培养基,37 ℃培养24 h,备用。


1.2.2 种子液的制备

从斜面上挑取一环培养物接种到装有20 ml 培养液的50 ml 三角瓶中,于30 ℃、220 r/min条件下震荡培养24 h,备用。


1.2.3 发酵培养

将上述种子培养液按1%的接种量接种于发酵培养基,装液量100 ml,于30 ℃、220 r/min条件下摇瓶培养48 h。


1.2.4 培养基的单因素试验

首先通过PB试验确定影响芽孢得率的显著培养基成分,再通过对显著成分的单因素试验,确定其最佳添加量。


1.2.5 培养条件的优化

在获得最佳培养基的基础上,对接种量以及发酵模式(震荡、静置)进行逐一优化。


1.2.6 计数方法

凝结芽孢杆菌的活菌总数采用稀释平板计数法;芽孢计数则采用把培养后菌液于80 ℃水浴15 min后稀释涂平板计数。

2结果与分析

2.1 不同培养原料对液体发酵产芽孢能力的影响

在试验过程中发现凝结芽孢杆菌B2在若干培养基平板上有产芽孢的能力,其中以加入淀粉的平板产芽孢最早,在24 h产生,以加入蛋白胨的平板为最高,因此,综合考虑,我们选择几种工业上发酵罐中常用的碳氮源作为PB实验的筛选因子,具体方案和结果见表1。结果分析见表2。


由表2可知,试验模型的R2值为0.91,表明实验有91%的数据能够用此模型拟合,模型情况较好。Shapiro-Wilktest表明数据符合正态分布。同时由表2可见,各因素的作用显著性排序为:蛋白胨>淀粉>大豆粉>葡萄糖>酵母膏>K2HPO4>(NH4)2SO4。其中显著的因素为蛋白胨、大豆粉和淀粉。


2.2 凝结芽孢杆菌芽孢形成培养基的确定

根据2.1 节所获得的结果,我们选择了蛋白胨、淀粉和大豆粉等3个因素为考察对象,其余因素取低水平。对此3因素进行单因素实验,摸索它们的最佳添加量。


由表3可知,淀粉最佳的添加量为0.2%、蛋白胨最佳添加量为0.5%、大豆粉最佳添加量为1.0%,结合2.1节的结果,确定凝结芽孢杆菌发酵产芽孢的最佳培养基为淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO40.02%。


2.3 接种量的单因素实验

在确定发酵培养基的基础上,进一步研究了初始种子接种量对发酵后芽孢数的影响,结果见表4。


由表4可知,随着初始种子接种量的增加,发酵后的芽孢数量也逐步提高,考虑到生产实际,合理的接种量应该控制在3%~5%。


2.4 不同的培养方式对凝结芽孢杆菌芽孢得率的影响

研究表明,提高通气量有助于凝结芽孢杆菌转变为芽孢,而静置培养又可提高初始菌数。因此我们选取了3种不同的作用方式,结果见表5。由表5可知,最佳的培养方式为连续摇瓶的方式,在此条件下,芽孢数量可以达到3.5×108 cfu/ml。


3讨论

随着微生态制剂研究成为饲料添加剂研究的热点,乳酸菌在动物饲养中的优势逐步显现。但绝大多数乳酸菌存在抗逆性差,不耐热的缺点,给制剂的保藏、运输都带来了较大困难,由于无法保证产品有效性,无法直接添加到配合饲料中使用。芽孢杆菌由于芽孢的生成,具有抗逆性强、耐高温和易储存等特点,很好地弥补了乳酸菌的不足,因而产乳酸芽孢杆菌的研究已成为益生菌菌株研发的热点。许多研究报道,凝结芽孢杆菌在源缺乏的情况下才会形成芽孢,在碳源充足的情况下不形成芽孢,菌体会发生自溶。同时无机盐在调控芽孢形成中发挥重要的作用,Mn2+对芽孢形成起到显著的影响,PO43-也有利于芽孢的形成,而K+ 和Na+对凝结芽孢杆菌的形成无明显的促进作用。

4结语

本试验通过研究表明最佳液体发酵培养基为淀粉0.2%、蛋白胨0.5%、大豆粉1.0%、葡萄糖0.1%、酵母膏0.07%、MnSO4 0.02%。培养条件接种量为2%~3%(v/v),培养方式为震荡培养。在此条件下,芽孢数量可以达到3.5×108 cfu/ml,优化后凝结芽孢杆菌产芽孢的能力都有了很大的提高。另一方面,本试验初步研究了凝结芽孢杆菌液体发酵芽孢形成的条件,还有一些因素值得探讨,比如培养温度,pH值以及培养时间等;培养温度过低会导致菌体生长缓慢,不利于芽孢形成;过高的温度会使菌体发生自溶,也不利于芽孢形成,因而有待进一步研究。

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