菌酶协同发酵对玉米的研究表明可提高蛋白的消化性，改善口感
玉米蛋白粉是玉米淀粉湿法加工的主要副产物，蛋白质含量约占60%左右，富含各种氨基酸，如丙氨酸、丝氨酸和亮氨酸。具有脂溶性蛋白质含量高、氨基酸不平衡、必需氨基酸含量低、消化性差等缺陷。
玉米蛋白粉作为一种高蛋白饲料原料，在动物生产中的应用也愈发广泛，然而动物采食后难以被胃、肠道吸收利用，导致玉米蛋白粉的利用效果较差。因此，提高玉米蛋白粉的有效利用率，适宜的预处理显得尤为重要。酶法改性是一种有效的手段，该方法可以有效降低玉米蛋白粉中的抗营养因子产生，从而增加底物的水解度和消化性，但酶解会促使玉米蛋白粉产生苦涩味道，影响口感，且存在耐热性差等问题。微生物发酵也能够提高蛋白质的利用率，发酵过程中产生的酶可以酶解底物中的大分子物质，降低抗营养因子的抗原性，并通过产生有机酸和抑菌物质发挥其抑菌活性，但微生物发酵存在菌株性能不稳定、耐受性低的问题。将两种改性方法进行有机结合，微生物发酵能够产生相应功能酶，与体系内酶发挥协同作用，共同促进底物酵解过程，显著缩短发酵周期，从而使底物分解成更易吸收的小肽。
研究表明菌酶协同发酵小米可以有效提高小米蛋白的消化性，改善口感。研究发现微生物发酵和酶水解预处理可以使玉米蛋白粉的蛋白结构发生改变，并且可以改善氨基酸平衡及动物的吸收和利用。研究发现微生物的繁殖和代谢的过程可抑制抗营养因子的产生，进而提高蛋白的可消化性。发现微生物发酵过程中会引进有机酸，使胃消化环境pH降低，胃蛋白酶活性升高，蛋白消化率升高。
因此，为进一步提高玉米蛋白粉的消化性，研究以玉米蛋白粉为原料，将乳酸菌发酵与酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶水解结合，采用单因素、正交试验确定最佳发酵工艺条件，并对直接影响玉米蛋白粉体外消化性的游离巯基含量、二硫键含量、表面疏水性、氨基酸等理化特性进行分析，以获得更高消化性的菌酶协同发酵产物，为菌酶协同发酵玉米蛋白粉提供技术支撑，并为玉米蛋白粉的生产加工和开发利用提供理论依据。
材料与方法
1.1材料与试剂
乳酸菌(活力为×1010 CFU/g)、酸性蛋白酶(活力为20 000 U/g、木瓜蛋白酶(活力为10
000 U/g)，玉米蛋白粉(蛋白质含量66%)。
1.2设备与仪器
ME104E电子天平；ZNCL-GS磁力加热搅拌器；RF5301PC荧光分光光度计，TU-1810紫外可见分光光度计，3-18KS台式高速冷冻离心机。
1.3试验方法
1.3.1复合酶酶解产物的制备
通过试验预处理，将玉米蛋白粉进行木瓜蛋白酶(添加量400 U/g、温度55℃、pH 6.0、时间3h)及酸性蛋白酶(温度40℃、添加量800 U/g、pH 3.0、时间3h）复合处理得到复合酶酶解产物。
1.3.2乳酸菌发酵复合酶酶解产物
利用乳酸菌发酵上述复合酶酶解产物，考察发酵温度( 33~41℃）、接种量(0.1 %~0.5%，质量分数)、料液比(1:2~1:6，g/mL)、发酵时间(12~36 h)对产物水溶性蛋白质含量的影响。
1.3.3福林酚法测水溶性蛋白
参照文献采用福林酚法测定产物水溶性蛋白质含量。吸取0.2mL的玉米蛋白粉水解液，加入0.8mL蒸馏水、5mL福林酚甲液，混匀10 min，再加入0.5mL稀释1倍的福林酚乙液，混匀并水浴（30℃、30 min)。然后用紫外分光光度计在最适波长处进行测定(640nm)按公式(1)计算水溶性蛋白质含量。
1.3.4游离巯基含量的测定
参考方法并进行适当的修改。称取400 mg不同改性产物添加量的冻干样品于10mL的0.2mol/L Tris-Gly缓冲溶液中，涡旋振荡5 min，离心机离心(5 000 r/min、15 min。取4mL上清液与0.1mL 10mmol/L的DTNB溶液混匀，静置20 min，用紫外分光光度计在412nm波长处进行测定，按公式(2)计算游离巯基的含量。
式中：n，标准曲线纵坐标游离巯基含量，μmol/mL；c，样品浓度，g/mL; SHF，游离巯基的含量，μmol/mL。
1.3.5二硫键含量的测定
取1.3.4中离心后的上清液1mL，加入0.1mL β-巯基乙醇和4mL的0.2mol/L Tris-Gly缓冲溶液，常温显色1h，然后添加10mL 12%的三氯乙酸，均匀混合1h，高速离心机离心(4 500 r/min ，15 min，保留沉淀，用5mL 12%的三氯乙酸溶液洗涤沉淀2次，洗涤完全后溶于10mL 0.2mol/L的Tris-Gly缓冲溶液，溶解后加入0.1mL 10mmol/L DTNB，静止20 min，用紫外分光光度计在412nm处测定吸光度后，按公式(3)和公式(4)计算总巯基含量。
式中：n，吸光度经标准曲线计算出的巯基含量，μmol/mL；c，样品浓度，g/mL；V1，上清液体积，mL；V2，沉淀复溶后体积，mL。
式中：SHT，总巯基含量，μmol/mL ；S HF，游离巯基含量，μmol/mL。
1.3.6表面疏水性的测定
以10mmol/L PB S溶液，pH为7.0配制蛋白溶液（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25mg/mL）
取2mL稀释液加入10μL ANS溶液(8.0mmol/L)中，并用荧光分光分度计激发波长为390nm、发射波长为470nm进行测定，以荧光强度随蛋白浓度变化的斜率表示表面疏水性。
1.3.7氨基酸组成分析
参照方法，使用氨基酸自动分析仪进行分析。
1.3.8体外消化率测定
采用体外胃-胰蛋白酶两步法测定菌酶协同发酵产物。称取10%浓度的样品于具塞三角瓶，调节pH值至2.0，加入30 mg的胃蛋白酶，用水浴摇床以39℃、120 r/min条件下振荡4h。调节pH值至7.5，加入30 mg的胰蛋白酶，再振荡3 h，取10mL消化液添加至15%三氯乙酸中，摇匀后静止30 min，4 000xg离心10 min。取上清液2g于消化管，凯氏定氮法测定上清液的含氮量，每个样品设置3个平行。如公式(5)所示:
结果与分析
2.1 乳酸菌发酵复合酶酶解产物
2.1.1乳酸菌发酵复合酶酶解产物单因素试验
以乳酸菌发酵的发酵温度、接种量、时间、料液比为试验因素，考察各因素对菌酶协同发酵产物水溶性蛋白质含量的影响，结果见图1。
由图1-a可知，随着温度升高，水溶性蛋白质含量整体趋势为先升高再降低，在37℃时水溶性蛋白质含量达到最大值。这是因为在37℃时乳酸菌生物活性最高。当温度不在该最适温度范围，乳酸菌的生物活性减弱，直接影响乳酸菌的发酵性能。
由图1-b可知，随着接种量的增加，水溶性蛋白质含量呈先升高后降低趋势，这是因为接种量会影响发酵体系内微生物的生长繁殖，随着接种量逐渐升高，发酵体系内微生物生长茂盛，从而使产生的水溶性蛋白质含量升高；而接种量过多会使发酵环境中菌与底物比过高，发酵环境中营养物质消耗殆尽，还有可能会产生发酵代谢物，导致发酵环境中产生有毒代谢成分。因此选择适宜接种量为0.4%（质量分数）。
由图1-c可知，随着发酵时间的延长，水溶性蛋白质含量升高，当发酵时间为24 h时，水溶性蛋白质含量达到最高。原因是短时间的发酵不能使玉米蛋白粉发酵完全；而发酵时间过长，底物随时间的延长而消耗完全，并且发酵产物过多会抑制反应的进行，导致乳酸菌的衰亡。因此选用发酵时间24 h。
由图1-d可知，当料液比在1:2~1:4 ( g/mL)时，水溶性蛋白质含量逐渐升高，在1:4~1:6
(g/mL)时，水溶性蛋白含量逐渐降低。这是因为水分含量的多少会影响乳酸菌的生长，水分含量过低时不利于乳酸菌的生长繁殖；过高时会促进有害菌(梭菌)发酵，抑制乳酸菌生长。因此发酵料液比选用1:4（g/mL）。
2.1.2正交试验设计
在单因素的基础上，采用L9（34）正交表优化乳酸菌发酵复合酶酶解产物的发酵条件。正交因素水平表如表1所示，正交试验结果如表2所示，方差分析结果如表3所示。
由表2可知，以水溶性蛋白质含量为评价指标，影响极差R大小的主次顺序依次为C>B>A>D，即料液比>加菌量>时间>温度。理论适宜组合为A2B1C2D3。即：发酵时间为24 h，发酵接种量为0.3%(质量分数)，发酵料液比为1:4（g/mL），发酵温度为39℃。
由表3可以看出，料液比对水溶性蛋白质含量影响差异显著。将理论适宜因素水平下进行验证试验，水溶性蛋白质含量为15.9 mg/mL，略高于已报道的玉米蛋白粉饲料发酵工艺中水溶性蛋白质含量（13.77 mg/mL），且有效的缩短了发酵时间。因此，乳酸菌发酵复合酶酶解产物最佳工艺条件为：发酵时间为24 h，发酵接种量为0.3 %(质量分数)，料液比为1:4 C g/mL，发酵温度为39℃。
2.2菌酶协同发酵对玉米蛋白粉游离巯基、二硫键及表面疏水性含量的影响
菌酶协同发酵对玉米蛋白粉的游离巯基、二硫键和表面疏水性的影响如图2所示。
巯基和二硫键是反映玉米蛋白品质变化的一个重要指标。由图2-a可知菌酶协同发酵产物的游离巯基含量由65.43μmol/g升高至88.42μmol/g，二硫键含量由67.06μmol/g降低至38.32μmol/g，这是因为菌酶协同发酵会使玉米蛋白粉的空间结构发生改变，使连接肽链之间的二硫键打开，导致游离巯基含量上升，玉米蛋白的空间结构松散，蛋白消化率发生改变。
由图2-b可知经菌酶协同发酵后的产物表面疏水性由71.94降低至10.97。这是因为菌酶协同发酵可以打开蛋白质的三、四级空间结构，促使酶与酶切位点结合，剪切长肽链，导致亲水基团从内部暴露出来，蛋白表面疏水性降低。
2.3菌酶协同发酵对玉米蛋白粉氨基酸组成分析
菌酶协同发酵对玉米蛋白粉的氨基酸分析如表4所示。
氨基酸是消化能力的大小的重要影响因素，发酵可使产物的氨基酸组成与原蛋白相比发生明显变化。菌酶协同发酵玉米蛋白粉氨基酸含量由表4可知，菌酶协同发酵产物中的氨基酸组成丰富，含15种不同氨基酸，含有苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸等6种必需氨基酸。其中必需氨基酸含量为22.54、23.56、25.70 mg/g，总氨基酸含量分别为64.56、66.91、72.27mg/g。
此外，菌酶协同发酵产物与玉米蛋白粉相比，必需氨基酸含量升高3.16 mg/g，总氨基酸含量升高7.71 mg/g，亲水氨基酸含量从32.19 mg/g升高至35.25 mg/g。这主要是因为玉米蛋白中多为不溶性的玉米醇溶蛋白，蛋白表面含有大量的疏水性氨基酸，且以二硫键和氢键维持其结构稳定。本研究利用复合酶酶解或者菌酶协同发酵玉米蛋白粉，一方面破坏了二硫键(见2.2二硫键含量分析结果)和氢键，导致醇溶蛋白表面疏水氨基酸含量减少，从而有利于暴露内部亲水性氨基酸；一方面，被破坏的疏水性氨基酸又在体系内形成更多新的氨基酸，从而使总氨基酸含量上升。已有研究表明提高亲水氨基酸的含量可提高蛋白质在体内的消化率。由此可知，菌酶协同发酵玉米蛋白粉产物的氨基酸较平衡，消化性能好。
2.4菌酶协同发酵产物的体外消化率分析
菌酶协同发酵玉米蛋白粉的体外消化率如图3所示。
体外消化率可表征营养物质在体内被消化利用的是否完全，还与微生物对饲料的作用能力有关。体外消化率直接可反映采食量和饲料可消化性。由图3可知，菌酶协同发酵可以提高玉米蛋白粉的体外消化率，由60.15%(玉米蛋白粉)升高至80.42 %，高于已有报道利用单一发酵所得玉米蛋白粉的消化率（67.10%）。这是因为蛋白原料的空间结构直接影响消化率。研究表明蛋白质疏水作用减弱、二硫键断裂、游离巯基含量上升，会使体外蛋白消化率升高。而由2.2可知，菌酶协同发酵玉米蛋白粉使疏水作用和二硫键显著下降，游离巯基含量显著上升，综上所述，菌酶协同发酵玉米蛋白粉会使体外消化率显著升高。
结论与讨论
菌酶协同发酵使玉米蛋白粉的二硫键含量、表面疏水性降低，游离巯基、氨基酸含量升高，从而显著提高玉米蛋白粉的体外消化率(由60.15%升高至80.42%）。同时，本研究成果为菌酶协同发酵玉米蛋白粉在饲料中的应用提供理论基础，也可为菌酶协同发酵玉米蛋白粉提供技术支撑。
二十余年酶菌结合发酵经验积累，更轻易成功以高浓度乳酸菌为主的酶菌结合生物饲料发酵剂，简单好用的中草药发酵剂，在2022年6月再次升级添加了増香增甜菌种，功能更强效果更好，但运用成本更低。
特别提醒：根据不同物料本品1包可以发酵1-5吨饲料，如果是第一次制作发酵饲料、需要发酵的原料霉变或变质较重、发酵环境温度较低（低于15℃）、粗纤维较高、需要加快发酵速度或者需要制作出更加香醇高品质的生物发酵饲料出来等情况，请按照本产品说明书使用量增加2-3倍的使用量即可。
（南宁微瑞生物科技有限公司是广西助农畜牧科技有限公司的直属下属公司）
【产品特点】
1.本产品采用以高浓度乳酸菌（300亿/g）为主要原料，结合了复合益生菌、酶制剂、酸化剂的诸多优点，能够发酵处理各种饲料原料、青绿饲料、秸秆粗饲料、各类食品加工下脚料糟渣等成为营养丰富的饲料，且能够降解饲料中的抗营养因子，提高饲料在动物肠道中的消化吸收利用率，是降低饲料成本、改善动物肉品质、改善养殖场环境（臭味氨气下降非常明显）的好方案，使用后养殖环境形成益生菌环境，对动物健康有较好的保健作用。
2.对霉变饲料及饲料原料具有脱霉作用，霉菌在厌氧发酵环境中无法生存，达到脱霉效果；对棉菜粕具有脱毒作用，通过酶制剂对抗营养因子的分解，并在发酵的过程中产生小肽。
3.产品中另外添加了新型增甜增香菌种，明显改善发酵料的适口性，使得处理后的发酵料增香增甜，动物对发酵料更爱吃。
4.客户鉴别本产品真假和一些发酵剂产品比较效果的简单方法：500~600毫升的空塑料瓶装入50克大米，倒入300毫升不超过40℃的干净温水，加入本品2-5克，盖上盖子摇动一下后放在温度30℃左右环境中每天几次小心放气，2～3天大米基本溶解成乳状。假冒发酵剂几乎不能溶解大米（也就是分解效果差），无大气体产生、发酵速度慢和香甜度差等，效果对比一目了然。
【产品使用方法】
一、制作液体菌液（保健菌液与加强型EM菌液）
将本品1包和200克红糖溶于20公斤的温水中（不高于45℃）密封发酵72小时以上（注意放气安全），就成为酶菌结合的益生保健菌液（加强型EM菌）要求长期密封保存一年以上有效，长期在畜禽水产养殖动物上按照饲料重量的0.3%-0.5%拌入饲料中饲喂，饮水按照0.2%添加，动物会非常喜吃，动物各阶段（包括孕畜）均可长期使用。也可以用液体菌液制作青贮饲料，每吨青贮饲料中加入液体菌液1-2公斤即可。
二、处理全价或自配饲料成无抗饲料
本品1包（500克）与全价颗粒饲料1000公斤（可以加入中草药20公斤效果更好），清水600公斤，混匀后放入陶瓷或者塑料桶中严格密封，3天后开始使用。使用时发酵的全价饲料10%-20%，未发酵的全价饲料80%-90%，周围疫情高发期发酵的全价饲料增加到20%-30%，使用后具有明显的保健效果与提高消化降低料耗的作用。
→长期在猪饲料中添加部分发酵全价饲料对比效果明显；→长期饲喂部分发酵全价饲料对猪生长、粪便臭味物质、血清抗氧化及免疫性能指标的影响
三、发酵木薯渣、豆渣、米粉面条加工下脚料、工厂学校剩饭、米糠、统糠、菌糠、酒糟、果渣果皮、青秸秆、牧草、红薯藤等原料
本品0.5-1包与1吨待发酵原料（部分原料需要粉碎），含淀粉类的饲料100公斤（比例约为原料的5%以上，如玉米、大米、红薯、淀粉均可，也可以用3公斤以上多糖性复合菌种营养基代替）、食盐2公斤（含有足量食盐的原料则不添加，食盐不能放在激活的菌种中，要直接撒在发酵料上或需要添加的清水中，下同）。含水量调节到55%-60%左右，压实密封发酵7天左右有浓郁香味时即可使用。发酵后的料适口性、营养、消化率较未发酵前有明显提升。发酵后的饲料根据不同动物与不同饲养周期按照10%-50%与该动物其他全价饲料混合后饲喂，不可以单独饲喂或全部饲喂发酵饲料。
四、霉变的饲料及饲料原料脱霉
每1吨霉变饲料或饲料原料添加本品1-2包、玉米粉400公斤（霉变原料中含有能量饲料如玉米粉、小麦粉等20%以上可无需另外添加玉米粉，也可以用5公斤以上多糖性复合菌种营养基代替），均匀混合后将物料含水量调节至60%左右，密封发酵7-15天后（夏短冬长，气温低于15度时建议在室内进行保温发酵）,发酵料有浓郁甜酒香味即可使用。脱霉后的饲料按照饲料比例的30%左右与饲养动物的全价饲料混合后饲喂，不可以单独饲喂。
五、对棉粕、菜粕、菜粕、棕榈粕、花生枯、茶枯的脱毒与生成小肽
本品0.5-1包、1吨待发酵原料、玉米粉100公斤（也可以用3公斤以上多糖性复合菌种营养基代替）、食盐2公斤。含水量调节到55%左右密封发酵一周以上。本产品不仅能够快速去除棉粕、菜粕、菜粕、棕榈粕等其中的抗营养因子（俗称其中的毒素），形成生物蛋白饲料代替豆粕提高消化吸收率，还能够在发酵过程中生成大量对动物有益的的小肽。
六、中草药及中药渣发酵方法
1.固态中草药发酵技术：将100公斤中草药粉碎，越细越好放入80公斤的35℃左右的温水中，加入玉米粉与豆粕各10公斤、本品1包、食盐200克，放入塑料容器内压实密封发酵7天以上后使用，密封可以保存一年以上，按照饲料比例的1%以上添加到饲料或饮水中使用。
2.液态中草药发酵技术（即发酵成为中草药活菌水的方法）：1-2公斤中草药（如“御瘟汤”）+1包本品+10公斤全价饲料（可以用750克以上多糖性复合菌种营养基或2公斤以上红糖代替）+100公斤清水混合在非金属容器中简单密封发酵72小时以上后使用（在半个月内使用完效果更好，且要持续密封保存，否则时间一长可能变质不能使用）。按照5%-10%的比例添加到动物饲料中饲喂，或2%-5%的比例添加的动物饮水中饲喂。
3.中药渣发酵：中药渣1立方，本品1包、玉米粉100公斤（也可以用3公斤以上多糖性复合菌种营养基代替）、豆粕50公斤（花生粕、菜粕、茶粕等均可），食盐3公斤，混合含水量调节在55%-60%左右，装入大容器或薄膜袋中压实密封发酵，一般一周左右有浓郁的甜酒香味即可使用，密封可以保存一年以上。发酵后的中药渣按5%以上的比例添加到饲料中。
非洲猪瘟防控期间运用这个方法更好——猪场复养增加自制发酵中草药体内外运用能够轻易成功，实施容易成本低，几乎不会失败
七、制作轻度全量发酵饲料及水料上的运用
本品0.5-1包、全价饲料1000公斤、清水600-800公斤混合发酵6-24小时后饲喂，形成轻度全量发酵预消化模式；或者清水增加到1500公斤以上形成水料发酵24小时内饲喂，两种模式能够达到更好的消化吸收率。
八、制作优质的青贮饲料
每吨青贮饲料中加入液体菌液2公斤即可，能够加速发酵、提高质量和适口性，且不容易失败还能够更长时间保存。
【配料说明和注意事项】
1、将本品放入约20倍的温水中化开2-24小时活化后再使用效果更好；在发酵物料时一定要压实密封，环境温度低于20℃建议适当保温或延长发酵时间；制作液体菌剂和密封发酵饲料过程中会产生气体注意放气安全；密封好不开封的情况下发酵料可以保存1年以上不变质。密封效果不好会导致发酵料表面霉变，饲喂时要铲除表面霉变的发酵料。
2、发酵料如果酸度过大，动物适口性差时可以在饲喂前混料时添加1%-2%小苏打中和酸度，改善动物适口性，或者降低发酵饲料的使用量。
3、发酵料开封进行饲喂后，建议7天内使用完，每次取料后要注意继续进行密封保存。
4、发酵料由于营养不全面，建议在饲喂混料时添加适当的能量饲料和蛋白饲料、预混料来调节营养配比，使动物达到更佳的饲喂效果和生长速度。
5、动物第一次饲喂发酵料必须遵循先少量饲喂然后逐步加量的原则，一般幼小阶段动物最大添加量10%-20%，中等阶段动物20%-30%，邻近出栏阶段30%-40%。在实际饲养中行适当的调整。
6、第一次使用发酵饲料可能会出现零星或者短时间的腹泻，这些都属于正常的现象。可以通过减少发酵料和添加药物进行调整。连续使用发酵料一周后会发现动物的消化率大大的提高，粪便变松软而且量变少，栏舍的氨臭味大大的减低。
7、饲喂本产品及发酵饲料不影响正常的动物免疫，动物发生疾病使用大剂量抗生素药物时，继续使用本品和发酵饲料无副作用，母畜与孕畜也可以使用。
【包装规格】500克/包，30包/箱。规模养殖场可以提供25公斤装或者进行产品定制。
【质保与储存】12个月，常温下于通风、阴凉、干燥处存放。
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