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青贮用拮抗黄曲霉并降解黄曲霉毒素菌株的筛选与鉴

2018-06-07 10:39:36      点击:


导读

青贮饲料中黄曲霉毒素的污染是一个全球性问题,为青贮饲料中霉菌毒素评定的主要指标(孟庆祥等,2016)。其中黄曲霉毒素B1(AFB1)被世界卫生组织列为毒物之首,定为IA类致癌物质,给动物生产性能和人类健康带来巨大的威胁(乔宏兴等,2017)。因此,青贮饲料中黄曲霉毒素的去除是反刍动物养殖者和科研机构重点关注的内容。

黄曲霉毒素常见的脱毒方法包括物理法、化学法和生物法。但是理化方法会对青贮饲料的质量和营养有不同程度的影响,甚至会引起污染。相较之下生物法应是最优的选择,生物脱毒主要有酶解法和微生物发酵法。酶解法近年来研究较多,但微生物降解酶的机理不明确、分离纯化过程复杂、酶的活性不稳定、酶作用条件苛刻等,难以在实际生产中推广和应用(计成等,2010)。目前,微生物法降解黄曲霉毒素已成为研究的热点,但主要集中在利用微生物发酵过程中产生的代谢产物进行脱毒,而通过生物竞争原理抑制黄曲霉生长从而降低霉菌毒素的产生和积累研究相对较少。由于黄曲霉毒素既可在作物田间生长时产生也可在仓储期间产生,所以如果筛选到拮抗黄曲霉生长并且降解黄曲霉毒素的双功能菌株,在青贮饲料中黄曲霉毒素的脱毒方面将具有很好的应用前景。

本试验拟通过平板扩散法和酶联免疫法筛选拮抗黄曲霉生长且降解黄曲霉毒素的菌株,并对活性较高的菌株进行性质研究和种属鉴定,为新型青贮剂的研制提供更多的毒素降解微生物种质资源。


1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品

牛粪、全株玉米青贮、土壤、牛奶、实验室保存的菌株等。


1.1.2 试验菌株

黄曲霉(Aspergillus flavus),由河北农业大学真菌毒素与分子病理学实验室提供。


1.1.3 培养基

发酵培养基:蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化钠8.5 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、葡萄糖1 g/L,pH 6.5 

香豆素培养基:KH2PO4 0.25 g/L、MgSO0.205 g/L、KNO3 0.5 g/L、(NH42SO4 0.5g/L、CaCl0.004 g/L、FeCl3 0.002 g/L,pH 7.0, 加入1 g 香豆素,固体培养基加入2%的琼脂粉。


1.1.4 试剂

香豆素,COOLABER科技有限公司;黄曲霉毒素标准品,美国Sigma 公司;黄曲霉毒素试剂盒,北京某公司;PCR 相关试剂,北京某公司;其他试剂均为国产分析纯。


1.2 方法

1.2.1 菌株的分离

称取土壤、牛粪等样品各10.0 g,分别加到装有100 mL 无菌水的三角瓶中,放于37 ℃,180 r/min 摇床中30 min。吸取混匀后的溶液1.0 mL 于装有9.0 mL 无菌水的试管中,用漩涡振荡仪混匀,将混匀液逐级稀释至10-7浓度。

分别吸取各种样品稀释度为10-5 ~ 10-7 的溶液100 μL 均匀涂布在NA 培养基平板上,37 ℃培养24 h 后挑选菌落形态各不相同的单菌落划线从而进一步纯化, 培养后观察菌落形态并编号记录,挑选单菌落接种至相应的斜面,置于4 ℃冰箱中保存。


1.2.2 菌株初筛

挑取保存在斜面上的菌株,分别点接在香豆素培养基上,37 ℃培养,如有菌落长出,则在香豆素培养基上传代3 次,如传代3次仍生长,则记录该菌株编号,进入后续试验。


1.2.3 菌株复筛

制作病原菌平板,待平板凝固后,使用直径为1 cm 的打孔器打孔。将初筛得到的菌株分别接种至NB 培养基,37 ℃摇床培养12 h,以5%接种量转接至发酵培养基,37 ℃培养48 h。取发酵液1.5 mL,10000 r/min 离心10 min,取上清液80 μL 注入病原菌平板的孔中,放在37 ℃的培养箱中培养,观察是否有抑菌圈的出现,并记录抑菌圈的直径。

选择抑菌圈直径较大的菌株接种NB培养基,37 ℃培养12 h 后, 转接到含AFB110 μg/mL的发酵培养基中,37 ℃培养3 d。通过酶联免疫试剂盒检测发酵液中剩余的AFB浓度,并计算AFB1 降解率。


1.2.4 菌株的鉴定

1.2.4.1 菌株的形态学鉴定

对菌落大小、菌落颜色、菌落质地、菌落边缘等特征进行鉴别。


1.2.4.2 菌株的分子生物学鉴定

利用PCR技术对菌落16S rDNA 进行扩增,并将纯化的PCR 产物送测序公司进行测序分析。将测序结果用BLAST软件与GenBank 中已登录的16S rRNA 基因序列进行同源性比较,通过CLUSTALX 和BIOEDIT等软件进行多重序列比对分析,并以Neighbor-joining法构建系统发育树(王伟等,2014)。


1.2.4.3 菌株的生理生化试验

根据16S rDNA序列分析的结果,对供试菌株进行生理生化试验,包括硝酸盐还原、厌氧生长、淀粉水解、明胶液化、V-P 测定、D-甘露醇发酵和丙酸盐利用等。


1.2.5 菌株的性质研究

1.2.5.1 菌株的pH 耐受性

制备种子液,按6.0%的接种量接种于pH 分别为3.5、4.5、5.5、6.5的发酵培养基中,37 ℃、180 r/min 摇床培养2 d后,测定菌株的生物量。


1.2.5.2 菌株的温度耐受性

制备种子液,按6.0%的接种量接种于发酵培养基中,分别在17、27、37、47 ℃,180 r/min 摇床培养2 d后,测定菌株的生物量。

2结果与分析

2.1 菌株的分离及初筛

共分离得到120株菌,其中45株菌可以在以香豆素为唯一碳源的培养基上生长。


2.2 黄曲霉拮抗试验

病原菌平板扩散法显示初筛获得的45株菌中有20株菌有抑菌圈。将抑菌圈的大小作为抑菌能力强弱的评判标准,通过量取透明圈的直径,共得到拮抗活性较高的菌株11株,如表1所示。


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2.3 黄曲霉毒素降解试验

通过酶联免疫试剂盒测定11株菌对AFB1 的降解率,结果见表2。11株拮抗菌株对AFB1 的降解率集中在60%~95%,N-1a的降解率最高,为95%。故选择该菌株作为待测菌株进行下一步试验。

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2.4 菌株的种属鉴定

2.4.1 菌株的形态学鉴定

菌株N-1a的菌落形态呈中间微凹状,四周隆起,乳白色,不透明。菌体呈直杆状,常以链状排列,革兰氏染色呈阳性,存在运动性,无荚膜,芽孢呈椭圆形。


2.4.2 菌株的分子生物学鉴定

将菌株N-1a的16S rDNA序列与GenBank中所有已测定的原核生物的16S rDNA序列进行比对,使用PHYLIPprogram package软件处理所得数据,得到了该菌株及相应标准菌株的进化距离并构建了系统发育树,见图1。由比对结果可知,与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)聚到了一起。

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2.4.3 菌株的生理生化鉴定

由于在系统发育树中N-1a与枯草芽孢杆菌聚到了一起,故选择枯草芽孢杆菌相关的项目进行生理生化试验,结果见表3。

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结果显示,菌株N-1a与枯草芽孢杆菌生理生化结果相一致,结合细菌菌落菌体形态和16S rDNA序列分析结果最终判定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。


2.5 性质研究

2.5.1 pH耐受性

菌株N-1a在pH为6.5、5.5、4.5和3.5时呈现不同的生长情况,如图2所示,随着pH的降低菌体浓度略有降低,但在pH为3.5时菌体浓度仍可达到108cfu/mL,表明该菌株具有较强的耐酸能力。

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2.5.2 温度耐受性

菌株N-1a在17、27、37℃和47℃均能生长,这样就能满足南北方不同气温下的青贮试验。如图3所示,菌株N-1a在37℃时生长量达到最高值,在27℃和47℃时菌体浓度仍能达到108~109cfu/mL。

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讨 论

Gonzalez等(2008)报道,玉米青贮前的霉菌含量超过了10cfu/mL,其中,污染类型以曲霉属为主,这与Keller等(2012)研究青贮饲料样品中霉菌污染情况一致。目前黄曲霉毒素对食品和饲料危害极其严重,然而在去除方法中,物理、化学脱毒的方法存在营养成分流失,脱毒不彻底的缺点。本研究采用微生物法,不仅避免了这些缺点,而且条件温和、安全环保,国内外研究表明微生物脱毒法拥有广阔的开发和应用前景。

由于黄曲霉毒素毒性较大,若直接用于筛选菌株,可能会威胁到人体的健康,而且黄曲霉毒素价格也相对较贵,所以本试验采用与其结构相似的香豆素为唯一碳源进行菌株的初筛。相比而言,香豆素的毒性较低,价格较低廉。李超波等(2012)利用此法筛选到10株能够在香豆素平板上正常生长的降解黄曲霉毒素的菌株,戴军等(2014)利用此法筛选得到27株高效降解毒素的菌株。所以香豆素作为初筛底物来筛选降解黄曲霉毒素的菌株,不仅毒性大大减弱,而且方便准确。

近年来已有利用黑曲霉(李冰等,2012)、枯草芽孢杆菌(孙玲玉,2014)、施氏假单胞菌F4(李超波等,2012)降解黄曲霉毒素的报道,但是降解率大多都集中在85%左右。本研究筛选到的菌株N-1a对黄曲霉毒素的降解率达到95%,优于先前其他研究。本试验菌株N-1a经鉴定为枯草芽孢杆菌,为国家饲料添加剂目录中的安全菌株,并且该菌株还具有对黄曲霉的拮抗活性,应用于青贮时可以达到对黄曲霉毒素防治结合的效果。

品质好的青贮玉米在青贮过程中pH会降低到4.0以下,北方地区进行玉米青贮时,秋季温度会低于20℃,故青贮菌株应具有耐低pH、耐高低温的性质。本试验筛选菌株N-1a在pH3.5及温度为17℃和47℃时生长情况均良好,是一株潜在的微生物青贮菌剂。


4结 语

本试验获得一株具有较高拮抗黄曲霉、降解黄曲霉毒素活性的枯草芽孢杆菌菌株,该菌株在pH3.5~6.5和温度17~47℃时生长情况均良好。



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