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两阶段调控优化保加利亚乳杆菌合成γ-氨基丁酸

2021-06-30 16:13:30      点击:

摘要:保加利亚乳杆菌ATCC 11842是制备富含γ-氨基丁酸(GABA)发酵饲料的优良益生菌。菌株生长的最佳初始pH为6.0,最佳温度为35℃。GABA生物合成的最佳pH为8.0,最佳温度为40℃。两阶段发酵调控保加利亚乳杆菌ATCC 11842 生产GABA,GABA的产量达到5.98g/L,优化后GABA产量比优化前提高了153.39%。

研究表明,两阶段分开控制菌株生长和GABA合成的pH和温度,能显著提高 GABA的产量。该方法为用保加利亚乳杆菌ATCC 11842生产富含γ-氨基丁酸的发酵饲料提供了科学依据。

γ-氨基丁酸(GABA)是一种天然存在的非蛋白质氨基酸,具有降血压、改善脑机能、增强记忆、抗焦虑等生理功能(Kantachote等,)。GABA作为饲料添加剂,能够提高动物抗应激能力,改善胴体品质和提高生产性能(汪祥燕等)。潘雪梅等研究发现,GABA可以缓解奶牛夏季的热应激,提高奶牛免疫能力和机体的抗氧化能力。Park等研究结果表明,GABA作为饲料添加剂能显著提高蛋鸡的生产能力,改善鸡蛋品质。常见的生产GABA的益生菌主要有酵母菌和乳酸菌(Kang等)。管军军等认为,乳酸菌是定植在动物肠道中的益生菌,有利于动物的肠道健康,常被用于制备发酵饲料,有助于动物的健康养殖。徐秀景等研究表明,乳酸菌发酵制备的固态发酵饲料,能够改善猪肉的品质,提高育肥猪的生长性能。乳酸菌与GABA的联合生产,能够显著改善饲料的营养品质。沈雪娇等研究发现,产GABA的短乳杆菌P-14发酵饲料应用于育肥猪的饲养,能提高其生产性能,改善猪肉的品质,提高饲料的报酬率。

保加利亚乳杆菌ATCC 11842是一种在食品加工领域重要的益生菌,在乳制品和功能饮料加工过程中已展现出良好的应用前景(毛雪等)。在饲料加工领域,保加利亚乳杆菌ATCC 11842也具有良好的应用前景。本研究通过探索保加利亚乳杆菌ATCC 11842生物合成GABA的规律,为生产富含GABA的发酵饲料提供科学依据。

1.材料与方法

1.1 材料与试剂

GABA标准品、MRS培养基和谷氨酸钠均购于北京某科技有限公司;

苯酚、硼酸、硼砂、次氯酸钠、氢氧化钠和无水乙醇均购于国药集团化学试剂有限公司;

保加利亚乳杆菌ATCC 11842保藏于江汉大学湖北省豆类(蔬菜)植物工程技术研究中心食品加工实验室。

1.2 仪器与设备

V-1600 紫外可见分光光度计:上海美谱达仪器有限公司;

TG165 型离心机:长沙平凡仪器仪表有限公司;

HH-2 型水浴锅:国华电器有限公司;

SPX-150B-Z 型生化培养箱:上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 菌体培养与 GABA 生物合成方法

菌体培养方法:保加利亚乳杆菌ATCC 11842活化培养基为MRS固体培养基,培养温度为30℃;保加利亚乳杆菌ATCC 11842生长培养基为MRS液体培养基,接种量为2%;生长液体培养基置于50mL离心管,装液量为48mL,调整液体培养基pH,控制培养温度,厌氧静置培养,培养36h;每个样品重复3次。

GABA生物合成方法:在菌体生长液体培养基中添加0.25g谷氨酸钠底物,调整液体培养基pH,控制培养温度,生物转化48h;每个样品重复3次。

1.3.2 菌体生物量测定方法

定时取0.5mL发酵培养基,6000r/min离心15min,弃上清液,用0.5mL无菌水悬浮菌体,在600nm条件下测定菌体光密度值(吴军林等)。在600nm波长条件下,绘制菌体生物量与光密度的标准曲线,从而计算出培养基中湿菌体的浓度。

1.3.3 GABA 样品制备及其检测方法

GABA样品制备:取1mL发酵液体培养基于1.5mL离心管,6000r/min离心10min,得到的上清液用于GABA含量的检测。

检测方法:取0.3mL上清液于25mL离心管中;依次加入0.2mL的0.2M硼酸盐缓冲液(pH9.0),1mL的6%苯酚溶液,0.8mL的5%次氯酸钠溶液,充分振荡混匀;置于沸水浴中保持10min;然后迅速置于冰浴中保持15min;剧烈振荡至显示蓝色;最后加入2mL的60%乙醇溶液;在645nm波长条件下检测光密度值(Zhang等)。

2.结果与分析

乳酸菌生物转化谷氨酸钠生物合成GABA分为两个阶段。第一阶段为乳酸菌的生长阶段,在此阶段需要提供乳酸菌良好生长环境,使乳酸菌达到最大的生物量;第二阶段是GABA的生物合成阶段,在此阶段需要控制谷氨酸脱羧酶良好的活性环境,谷氨酸钠在谷氨酸脱羧酶的催化作用下生物合成GABA(Ttt等)。Shi等研究表明用短乳杆菌静息细胞生物转化谷氨酸生成GABA有两个关键的控制因素,一是pH控制在4.5,二是温度控制在45℃。Peng等研究结果也表明分步控制温度和pH条件,用短乳杆菌CGMCC 1306生物转化谷氨酸能获得良好的转化效率。因此,本研究探索分两阶段分别控制菌株的生长和GABA的生物合成,以期提高GABA的产量。

2.1 pH 和温度对菌株生长的影响

由图1可知,pH能显著影响保加利亚乳杆菌ATCC 11842的生长。在菌株生长36h时,pH为5、6、7、8、9时的菌体生物量分别为11.60、17.10、15.58、13.93、9.48g/L。pH高于9时,菌株的生长受到显著抑制。pH为6时菌株的生长最佳。终产物乳酸的积累是抑制乳酸菌生长的重要原因,调节培养基初始pH会影响乳酸菌生长。闫征等研究表明,调节培养基初始pH,乳酸菌在pH6和pH6.5条件下,表现出较好的生长。杨静等的研究结果也表明,乳酸菌生长的最适pH为5.5~7.0。

由图2可知,温度能显著影响保加利亚乳杆菌ATCC 11842的生长。在菌株生长36h时,温度为25、30、35、40、45℃时的菌体生物量分别为13.60、15.44、16.90、15.62、5.40g/L。温度高于45℃,菌株生长受到明显抑制。其中35℃是菌株生长的最佳温度。王奎明研究结果表明,保加利亚乳杆菌在MRS培养基中和37℃条件下生长良好。培养基组分也会影响保加利亚乳杆菌的最适培养温度。曾少葵等以牡蛎酶解液为原料,保加利亚乳杆菌的最适生长温度为40℃。

2.2 pH 和温度对 GABA 生物合成的影响

pH和温度会影响酶分子的活性结构以及酶分子与底物的结合(周文斯;陈稳等)。调控反应的温度和pH对谷氨酸脱羧酶活性有重要影响,进而影响GABA的生物合成(Wu等;时粲等)。

保加利亚乳杆菌ATCC 11842在MRS液体培养基中生长36h时,培养基pH降为6.0,当添加0.25g谷氨酸钠后,培养基pH变为4.5。在此基础上调整发酵液的pH分别至5、6、7、8、9,温度为35℃,生物转化48h后,比较GABA的产量。由图3可知,pH能显著影响GABA的产量。在pH为5、6、7、8、9五个不同条件下GABA产量分别为3.25、3.30、3.75、5.0、3.71g/L。其中pH为8时GABA生物合成量最高。随着菌株的生长,菌株产酸也会使发酵液的pH降低。孟丹等研究表明,乳酸乳球菌乳亚种HUCM 201生物合成GABA最佳初始pH为6.5,其发酵液中γ-氨基丁酸的质量浓度为0.22g/L。曾林等从四川泡菜中分离出一株具有产GABA能力的植物乳杆菌BC114,并对其发酵条件进行优化,结果表明,其最佳pH为5.50,GABA产量为3.82g/L。

由图4可知,温度能显著影响GABA的产量。在温度为25、30、35、40、45℃条件下的GABA产量分别为2.57、2.69、3.33、4.77、3.96g/L。其中40℃是GABA生物合成的最佳温度。韩昱姝等从泡菜中筛选出一株短乳杆菌LF-fb-017,其GABA产量可达1.68g/L,其最佳生物转化温度为37℃。Park等研究结果也表明,乳酸菌来源的谷氨酸脱羧酶最佳活性温度为41℃。

2.3 优化前后 GABA 产量的比较

参照前期研究方法,保加利亚乳杆菌ATCC 11842在MRS培养基中生物转化谷氨酸钠合成GABA,在自然pH和恒温30℃条件下,GABA产量为2.36g/L(Wang等)。用两阶段调控生物合成GABA的方法,菌株在初始pH6.0,温度35℃条件下生长36h,再调整发酵液pH至8.0,温度调整至40℃,生物转化48h,GABA的产量达到5.98g/L,如图5。优化后GABA的产量较优化前GABA的产量提高了153.39%。张竺英等(2014)从豆豉中筛选的产γ-氨基丁酸的乳酸菌HY15,该菌株在含1%(W/W)谷氨酸钠的MRS发酵培养基中,37℃厌氧培养48h后,发酵液中GABA产量达到0.161g/L。史晓萌等从哈萨克族传统发酵食品中筛选出一株乳酸乳球菌KCH1,GABA产量达329.81mg/L。吴非等利用紫外线对GABA高产菌株保加利亚乳杆菌L2进行诱变处理,获得高产GABA突变菌株L2-4,其在含有1%L—谷氨酸改良MRS培养基中的GABA产量达到4.235g/L。因此,保加利亚乳杆菌ATCC 11842 GABA的合成能力显著高于上述报道的乳酸菌株。

3.结论

本试验结果表明,对菌株生长和GABA生物合成的pH和温度进行两阶段分开控制,能显著提高GABA的产量。菌株在初始pH 6.0,温度35℃条件下生长36h后,再调整发酵液pH至8.0,温度40℃,GABA的产量达到5.98g/L。优化后GABA的产量较优化前GABA的产量提高153.39%。


多功能生物发酵活菌肽——无抗养殖推荐产品,益生菌发酵中草药组合的动物肠道保健的佼佼者,提高动物健康水平减少死亡淘汰率,降低料耗增重加快提前出栏,快速降低养殖栏舍臭味

多功能生物发酵活菌肽-产品说明书

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本产品由多种特异性乳酸菌、产酶芽孢杆菌、布拉氏酵母、产朊假丝酵母、酿酒酵母、双歧杆菌、丁酸梭菌与部分中草药发酵而成的高活性发酵饲料产品。

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打开多功能生物发酵活菌肽香气四溢并可以长时间保持,多功能生物发酵活菌肽包装内物料,颜色会随着时间长短而有所变化,样品打开后由于接触空气在一周左右可能会霉变,请及时饲喂或者丢弃。产品打开包装后要及时密封,并请在7-15天内喂完,以免接触空气后产生霉变影响质量。

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客户反馈使用后蛋鸡增产明显

【用法用量】

猪各阶段、牛羊、鸡鸭鹅家禽与特种养殖上均可使用。混合饲料中饲喂,也可以单独少量直接补充洒在料槽中饲喂。由于本品1公斤相当于约1.5~2公斤全价饲料能量,在每吨全价饲料中添加本品1包(20公斤)的情况下,可以减少全价饲料40公斤(1包)的使用量。

1.养猪上的运用:日常中每吨饲料使用本品1包(20公斤),初次使用与在周围疫情严重、泌乳期、出栏前1个月可以增加2-4倍的使用量。仔猪、肉猪、母猪各阶段都可以使用,用药和免疫期间不需要停止无副作用。可以与部分全价饲料简单混合后进入自动供料系统中运用。

2.家禽上的运用:每吨饲料使用本品1包(20公斤),初次使用与在周围疫情严重、蛋禽、出栏前1个月可以增加2-3倍的使用量。

3.牛羊上的运用:每1吨精饲料中使用本品3-5包。

4.特种动物养殖上的运用:每1吨饲料中添加本品2包,出栏前一个月增加一倍的使用量;部分昆虫养殖上运用本品也有恢复肠道健康和解决一些疑难问题。

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5、直接撒喂方法:如果混料不方便等,可以将本产品单独直接洒到畜禽养殖区投喂,撒喂比例按照1吨饲料运用本品1包的使用量饲养区域,尽量撒散开确保每只畜禽都能够吃到。由于本产品非常香醇可口,畜禽都会抢吃干净。每天撒喂1次即可。

6、饮水中运用本产品的方法:规模养殖场自动饮水系统的操作需要将本产品1包放入网纱袋内,浸入到1吨水中来回揉搓3分钟以上,大部分本产品会融入水中,剩余不溶解的残渣直接投喂或者拌料。每吨饮水中添加1公斤红糖并且静止半小时以上再给动物饮水效果更好;小规模养殖场或者不是自动饮水的养殖场,将本产品1包直接倒入到1吨饮水中后搅动一下给动物饮用即可(加入1公斤红糖静止半小时以上效果更好)。本产品益生菌数量多,且中草药也会大部分会释放出来,因此饮水也是能够达到很不错的效果。

【视频】部分发酵饲料养猪鸡鸭带给你无臭味健康无抗养殖效果

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2020年已全面禁抗,我们之前经常在饲料中添加的抗生素进行促生长行为将是违法,否则面临巨额罚单。如何既能够促进动物生长又能够形成无抗养殖呢?其实中草药在促进畜禽养殖健康和生长、改善肉蛋奶品质大有可为,特别是将中草药发酵后效果提升4-28倍等好处,这个实施方案比你想象中效果更好,运用的没有不被效果折服的,值得尝试验证

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