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一株丁酸梭菌的分离鉴定及其益生特性研究

2020-10-29 15:08:54      点击:

摘要:本研究探索了丁酸梭菌分离株的益生特性,旨在为其在仔猪日粮中的应用提供理论依据。利用常规方法分离丁酸梭菌并进行纯培养,经生化检测和16S rRNA基因测序,对分离菌株进行鉴定;采用活菌计数法和牛津杯法研究分离株培养上清对3种致病菌的抑制作用、分离株黏附猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的特性及其对致病菌黏附细胞的抑制作用;采用细胞计数法研究分离株对IPEC-J2生长的影响;采用ELISA检测分离株处理细胞后培养上清液中细胞因子水平。结果表明,本研究成功分离到一株丁酸梭菌。与对照组相比,丁酸梭菌培养上清对3种致病菌生长抑制效果均显著(P<0.05);丁酸梭菌可黏附于IPEC-J2,并且黏附效果最佳的感染复数(MOI)为50,最适处理时长为3h;丁酸梭菌对3种致病菌黏附IPEC-J2均具有显著抑制作用(P<0.05);丁酸梭菌MOI为1、10和50时细胞生长正常、形态完好,MOI为100时IPEC-J2生长受到显著抑制,同时出现部分细胞死亡;MOI为1时细胞因子水平无差异,MOI为10、50和100时细胞因子水平均显著增高(P<0.05)。综上所述,本研究分离的一株丁酸梭菌具有较好的益生特性,为其在生产中的应用提供了理论依据。

仔猪出生后通过母乳获得免疫保护,而断奶后常表现出抵抗力下降,易发生腹泻,死亡率增加。致病性细菌是引起仔猪肠道疾病的一类病原,例如常见的产肠毒素大肠杆菌(enteroinvasive escherichia coli,ETEC)和沙门氏菌(Salmonella),引起仔猪腹泻,给猪生产带来了一定的经济损失。为了提高养猪效益,通常在饲料中添加抗生素来防治疾病。虽然抗生素在预防动物疾病、促进畜禽生长、提高饲料转化率和畜产品品质等方面起到了重要作用,但随着抗生素的大量使用,出现了耐药菌株和抗生素残留等问题,严重威胁到畜牧业自身效益和人类健康。

近年来,人们开始研究利用益生菌调节仔猪肠道菌群平衡和免疫发育,以减少或替代抗生素的使用,提高仔猪抗病力。丁酸梭菌是人和动物肠道内的正常菌群,具有调整肠道微生态平衡、产生益生产物和增强机体免疫等作用。2003年欧盟批准丁酸梭菌作为饲料添加剂用于断奶仔猪和肉鸡。2009年7月,原农业部批准丁酸梭菌可作为饲料添加剂用于生产,并于2013年将其纳入《中国饲料添加剂品种目录(2013)》的《附录二》中。目前,丁酸梭菌在提高畜禽生产性能、防治动物细菌性疾病和提高动物性食品安全等方面已经表现出积极的作用。

本研究从健康仔猪粪便中分离鉴定出一株丁酸梭菌,探索该分离株培养上清液对致病性大肠杆菌和沙门氏菌的生长抑制作用,对两类致病菌黏附猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的抑制作用以及对IPEC-J2生长和免疫反应的影响,以期为丁酸梭菌在仔猪日粮中的广泛应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞和菌株

IPEC-J2、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌K88均为天津师范大学生命科学院动物营养与饲料实验室保存。

1.2 主要试剂

RPMI Medium 1640 basic培养基、胰蛋白酶EDTA消化液和胎牛血清均购自Gibco公司;青链霉素、硫酸庆大霉素和TritonX-100均购自北京索莱宝生物公司;TRIzol试剂盒、Taq酶、dNTPs均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;猪白细胞介素-1β(IL-1β)、猪白细胞介素-8(IL-8)、猪肿瘤坏死因子(TNF-α)检测试剂盒均购自BD公司。

1.3 主要培养基

梭菌选择培养基(TSN培养基),用于丁酸梭菌的分离培养,其配方为:胰蛋白胨17g/L、大豆蛋白胨3g/L、氯化钠5g/L、磷酸二氢钾2.5g/L和葡萄糖2.5g/L;梭菌增殖培养基(RCM培养基),用于丁酸梭菌的纯培养,其配方为:酵母浸粉3g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、可溶性淀粉1g/L、葡萄糖5g/L、半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、氯化钠3g/L和乙酸钠3g/L;LB培养基由胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L和氯化钠10g/L组成;普通肉汤培养基由蛋白胨10g/L、牛肉膏5g/L和氯化钠5g/L组成。上述各培养基分别加入2%琼脂即可配成固体培养基。培养基所用的各种化学试剂均为化学纯。

1.4 丁酸梭菌的分离

无菌称取健康断奶仔猪的新鲜粪便5g,用无菌生理盐水稀释至10-5、10-6、10-73个梯度,分别取200μL粪便稀释液接种于TSN培养基中,置于37℃恒温培养箱中静置厌氧培养48h,观察菌落形态特征。对可疑菌落进行革兰氏染色,用显微镜油镜观察不同菌落的菌体特征和染色特性,选取符合丁酸梭菌形态特征的菌落划线接种RCM培养基继续培养,直到得到可疑菌落的纯培养物。

1.5 丁酸梭菌生理生化及16S rDNA鉴定

参照《伯杰氏细菌鉴定手册》对可疑菌落的纯培养物进行生理生化鉴定。鉴定项目包括硝酸盐还原、明胶液化、吲哚、硫化氢产生以及蜜二糖、松三糖和淀粉的发酵。

将细菌通用引物(27F:5′-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3′;1492R:5′-GGCTACCTTGT-TAC GACTT-3′)委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。离心收集培养至对数生长期的分离株纯培养物,采用taco试剂盒提取基因组DNA,以其为模板,对细菌16SrDNA进行PCR扩增。PCR反应参考梁东梅等报道,PCR体系50μL:DNA模板2μL,Taq酶(5U/μL)1μL,dNTP(10mmol/L)1μL,上、下游引物各1μL,10×Buffer 5μL,ddH2O 39μL。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性25s,62℃退火25s,72℃延伸90s,40个循环;72℃终延伸3min;16℃2min。利用1.0%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测,将扩增片段大小为1 500bp左右的阳性产物进行纯化,纯化产物送金唯智生物公司进行核苷酸序列测定。利用NCBI数据库中的BLAST工具将测序结果进行同源性分析,确定分离株的属种。

1.6 丁酸梭菌抑制致病菌能力的测定

将丁酸梭菌接种于RCM培养基,37℃静置过夜培养48h,离心,收集培养上清液,置4℃保存,用于分析其培养液抑菌能力。

1.6.1 牛津杯法测量抑菌圈直径  

试验方法参考梁东梅等报道,将2.0%琼脂水倾注于培养皿中,待凝固后等距离放入4个牛津杯,将含致病菌(浓度为1×108CFU/mL)的LB固体培养基混匀后缓注入平板中,待培养基凝固后,用镊子拔出牛津杯。取150μL丁酸梭菌培养液加入牛津杯中,同时用RCM培养液作为空白对照,试验组和对照组各做3个重复孔。将培养皿在4℃放置2h,待孔内液体完全扩散后转至37℃倒置培养24h,测量各孔抑菌圈直径。

1.6.2 活菌计数法进行菌落计数  

试验方法参考梁东梅等报道,将丁酸梭菌培养液分别与大肠杆菌(浓度为1×108CFU/mL)和沙门氏菌(浓度为1×108CFU/mL)混合作用,每种致病菌分别做3个重复,作用时长均为0、5、15、30和60min,然后将致病菌倍比稀释,大肠杆菌稀释液涂布LB琼脂板,沙门氏菌稀释液涂布普通肉汤琼脂板,37℃培养24h,进行菌落计数。每个作用时间点分别做3次菌落计数。

1.7 丁酸梭菌对IPEC-J2生长的影响

用含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM-1640培养基培养IPEC-J2,培养条件是37℃、5%CO2。将生长至对数期的细胞接种至12孔细胞培养板,待细胞生长密度至80%(细胞浓度为5×105地5个/孔),再分别加入MOI(MOI=细菌数量/细胞数量)为1、10、50和100的丁酸梭菌,同时设DMEM培养液作为空白对照组,每个处理组做3个重复孔。待丁酸梭菌处理细胞3h后,弃掉培养液,用DMEM清洗3次细胞以去除未黏附的细菌,显微镜下观察细胞生长状态及死亡情况。观察结束后,将每孔细胞消化并收集于离心管中,1 000r/min离心4min,弃上清,加入不含血清的培养液将细胞吹打均匀,经台盼蓝染色后,在显微镜下进行细胞计数。

1.8 丁酸梭菌黏附IPEC-J2能力的测定

1.8.1 丁酸梭菌黏附细胞的时间依赖性  

将IPEC-J2接种至24孔细胞培养板,待细胞生长密度至80%,分别加入MOI为50的丁酸梭菌,37℃分别孵育3、6、12和24h,每个处理组做3个重复孔。孵育结束后,弃去培养液,用DMEM清洗3次以去除未黏附的丁酸梭菌,然后每孔加入100μL 0.5%TritonX-100,孵育8min以裂解细胞,然后加900μLPBS终止裂解,吹打混匀后吸出样品,最后将样品进行梯度稀释后涂板计数,即丁酸梭菌黏附数。

1.8.2 丁酸梭菌黏附细胞的剂量依赖性  

细胞培养至24孔板的方法同1.8.1,分别加入MOI为1、10、50和100的丁酸梭菌,37℃孵育细胞3h,每个浓度处理组做3个重复孔,用于丁酸梭菌黏附细胞数的测定。细胞裂解和细菌计数方法同1.8.1。

1.9 丁酸梭菌抑制致病菌黏附IPEC-J2能力的测定

将IPEC-J2接种至24孔板,待细胞生长密度至80%,用MOI为50的丁酸梭菌处理3h,然后清洗细胞3次,以去除未黏附细胞的丁酸梭菌,再用大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌分别感染细胞0、3、6、12和24h,感染剂量均为1×103CFU/孔。感染结束后,按照1.8.1方法进行细胞裂解和致病菌计数,每个处理组的每个处理时间均做3个重复孔。

1.10 丁酸梭菌对IPEC-J2免疫应答的影响

将IPEC-J2接种于24孔板,待细胞生长密度至80%,分别使用MOI为1、10、50和100的丁酸梭菌作用IPEC-J2,以不加丁酸梭菌的处理为空白对照组,每个浓度处理做3个重复孔。丁酸梭菌处理细胞3h后,收集培养上清液,按照检测试剂盒说明书测定IL-1β、IL-8和TNF-α。

1.11 数据分析

使用Excel进行数据整理,采用SPSS 20.0软件OneWay ANOVA进行单因素方差分析,并采用t检验进行组间差异性检验,结果以平均值±标准差表示,P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 分离株的生长性状及显微特征

将分离纯化的菌株划线接种于RCM培养基,37℃厌氧培养24h,可见菌落直径1~3mm,呈圆形凸起、边缘整齐、表面湿润光滑有光泽、乳白色或淡奶油色、不透明,且略有酸臭味。将分离菌进行革兰氏染色,油镜下可见菌体为直杆状或稍有弯曲,两端钝圆,革兰氏染色呈阳性(图1)。

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2.2 分离株的生化及PCR鉴定

对该分离株进行硝酸盐还原、明胶液化、淀粉水解、糖发酵等试验,其鉴定结果如表1。从菌落形态以及生化反应结果来看,该菌株的特征与丁酸梭菌是一致的,初步鉴定该分离株为丁酸梭菌。

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提取丁酸梭菌分离株的基因组,以其为模板进行16S rDNA的PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后结果见图2,可见一条大小为1 500bp左右的特异性条带,与预期条带大小相符。将目的条带进行胶回收纯化和核苷酸测序,并将测序结果在NC-BI数据库中进行BLAST比对,结果表明,该菌株的16S rDNA基因序列与丁酸梭菌(NCBI登录号:KC196777.1)同源性达100%,因此确定该分离株为梭菌属丁酸梭菌。


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2.3 丁酸梭菌抑制致病菌的能力


丁酸梭菌培养上清液抑制致病菌能力的结果见表2和表3。其中表2为牛津杯法测定的试验结果,对照组是RCM培养液,其抑菌圈直径为0mm,对致病菌无抑制作用,而丁酸梭菌培养上清液作用大肠杆菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌后,抑菌圈直径分别为25.0、26.3、28.4mm。由此可知,丁酸梭菌培养上清对这3种致病菌均有良好的抑制作用,其中对鼠伤寒沙门氏菌的抑制作用最强。

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活菌计数法试验结果见表3。由表3可知,与丁酸梭菌培养上清液和大肠杆菌作用0min相比,丁酸梭菌培养上清液作用大肠杆菌5、15、30、60min后抑菌力分别提高了53.33%、56.67%、68.33%、78.33%;与丁酸梭菌培养上清液和猪霍乱沙门氏菌作用0min相比,丁酸梭菌培养上清液作用猪霍乱沙门氏菌5、15、30、60min后抑菌力分别提高了56.67%、60.33%、69.67%、78.67%;与丁酸梭菌培养上清液和鼠伤寒沙门氏菌作用0min相比,丁酸梭菌培养上清液作用鼠伤寒沙门氏菌5、15、30、60min后抑菌力分别提高了59.67%、61.33%、70.33%、83.33%,并且随着丁酸梭菌培养上清液作用时间的延长对这3种致病菌的抑制作用均有所增强。由此可见,牛津杯法和活菌计数法测定丁酸梭菌抑菌能力的试验结果是一致的。试验数据表明,丁酸梭菌能够有效抑制3种致病菌的生长,抑制作用由强到弱依次为鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌和大肠杆菌。

2.4 丁酸梭菌对IPEC-J2生长的影响

用不同剂量的丁酸梭菌处理IPEC-J2细胞3h,显微镜下观察细胞生长状况,当MOI为0、1、10和50时细胞生长状况均良好,表现为细胞透明度大、折光性强、轮廓不清,当MOI为100时,细胞折光性降低、轮廓增强、细胞之间空隙增大、细胞形态不规则,少量细胞甚至死亡,漂浮在细胞培养液中。由此可见,MOI为1、10和50时丁酸梭菌对细胞的正常生长无可见影响,当MOI为100时,丁酸梭菌会影响细胞的正常生长,造成细胞损伤甚至死亡。显微镜观察后,将细胞消化收集,并进行台盼蓝染色和细胞计数,结果见图3。由图3可知,与对照组相比,MOI为1、10和50时试验组细胞数均无显著差异,MOI为100时试验组细胞数显著降低(P<0.05),由此可见,丁酸梭菌处理浓度MOI为100时影响了细胞的正常生长。

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2.5 丁酸梭菌黏附IPEC-J2的能力

不同作用时间对丁酸梭菌黏附IPEC-J2能力的影响见表4。由表4可知,与丁酸梭菌作用细胞3h相比,丁酸梭菌作用细胞6、12h,其黏附指数分别增加4.9%、4.0%,丁酸梭菌作用24h时,黏附指数降低了1.8%,无显著差异(P>0.05),其中作用时长为6h时丁酸梭菌黏附细胞的数量最多,说明丁酸梭菌对猪肠上皮细胞具有很好的黏附性。不同作用浓度对丁酸梭菌黏附IPEC-J2能力的影响见表5。由表5可知,与MOI为1相比,MOI为10、50、100时,丁酸核菌的黏附能力均显著增加(P<0.05),且以MOI为50时丁酸梭菌的黏附能力最强。显微观察发现,MOI为100时,较多的细胞形态发生了改变,并伴有部分细胞漂浮于培养液中,因此,丁酸梭菌处理浓度MOI为100时对细胞具有损伤作用。

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2.6 丁酸梭菌对致病菌黏附IPEG-J2的影响

丁酸梭菌对致病菌黏附IPEG-J2的影响结果见表6。由表6可知,与大肠杆菌刺激细胞0h相比,大肠杆菌刺激细胞3、6、12和24h时,其黏附数分别降低了11%、36%、43%和25%;与猪霍乱沙门氏菌刺激细胞0h相比,猪霍乱沙门氏菌刺激细胞3、6、12和24h时,其黏附数分别降低了25%、40%、50%和17%;与鼠伤寒沙门氏菌刺激细胞0h相比,鼠伤寒沙门氏菌刺激细胞3、6、12和24h时,其黏附数分别降低了35%、47%、55%和16%;并且3种致病菌均以作用细胞12h时其黏附数降低为最多。试验数据表明,丁酸梭菌能够有效抑制3种致病菌黏附IPEG-J2,其抑制效果由强到弱依次是鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、大肠杆菌。


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2.7 丁酸梭菌对IPEC-J2免疫应答的影响

丁酸梭菌对IPEC-J2免疫应答的影响见图4,与对照组相比,丁酸梭菌处理浓度MOI为1时,IL-1β、IL-8和TNF-α的浓度均没有显著变化(P>0.05);丁酸梭菌处理浓度MOI为10时,IL-8和TNF-α的浓度均显著增加(P<0.05),而IL-1β的浓度没有显著变化(P>0.05);丁酸梭菌处理浓度MOI为50和100时,IL-1β、IL-8和TNF-α的浓度均显著增加(P<0.05)。


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3 讨 论

3.1 丁酸梭菌抑菌能力

本研究分别采用牛津杯法和活菌计数法分析获得丁酸梭菌分离株抑菌活性,结果表明丁酸梭菌分离株对大肠杆菌和沙门氏菌均具有很强的抑制作用。已有研究表明,丁酸梭菌可能通过丁酸、抗菌肽等物质抑制致病菌的生长。贾丽楠等研究表明,丁酸梭菌发酵液上清对大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌等均具有明显的抑制作用,并且进一步研究发现,起抑菌作用的为有机酸、蛋白或多肽类物质。威胁断奶仔猪肠道健康的致病菌除大肠杆菌和沙门氏菌外,还有其他病原菌如丹毒杆菌和链球菌等,因此,丁酸梭菌对于其他动物肠道病原菌的生长繁殖是否具有抑制作用还有待进一步研究。

3.2 丁酸梭菌黏附及竞争性黏附能力

本研究的3种肠道致病菌均是通过定植于动物肠道产生一些对动物生长有害的产物,从而导致动物发病。大肠杆菌主要通过菌毛及纤毛蛋白结构中的黏附因子定殖于小肠黏膜并与小肠黏膜上皮细胞上的相应受体结合,释放肠毒素引起腹泻。沙门氏菌是引起6个月以下仔猪副伤寒的主要病原菌,菌体表面有菌毛,利于菌体在黏膜及组织细胞上黏附,不利于病原菌的清除。

丁酸梭菌发挥益生作用主要是通过定植在细胞表面后竞争营养物质和黏附部位,从而阻挡病原菌与细胞表面的受体结合,达到抑制致病菌黏附细胞的目的,在一定程度上降低致病菌的增殖。由于在动物体内很难准确的判定细菌对细胞的黏附能力,因此应用体外细胞试验研究细菌的黏附能力是目前最常用的方法。本研究采用IPEC-J2为试验模型,用丁酸梭菌分离株作用细胞后检测其黏附能力。利用不同浓度的丁酸梭菌黏附细胞,检测黏附数的变化。试验结果表明,丁酸梭菌对肠上皮细胞具有较好的黏附性,结合丁酸梭菌对细胞生长状况的影响及其黏附细胞的结果,最终确定丁酸梭菌的最佳MOI为50。本研究中发现,丁酸梭菌MOI为100时,会引起细胞损伤甚至死亡,并且丁酸梭菌的黏附数会下降,可能是因为丁酸梭菌产生丁酸等代谢产物使细胞培养液的pH降低,对细胞生长产生了不利影响。用丁酸梭菌的最佳感染浓度处理细胞,随着作用时间的延长,丁酸梭菌黏附细胞的能力增加,但是其黏附数差异并不显著,为缩短试验周期,后续试验选择黏附的最适时长为3h,当作用时间为24h时,丁酸梭菌黏附能力下降,这可能是由于细胞培养液中的营养物质用尽,也可能是由于细胞表面的黏附受体有限,导致丁酸梭菌黏附数达到饱和导致黏附率下降,关于这一现象出现的原因目前在丁酸梭菌上研究较少,需要进一步研究。

梁东梅等研究发现,植物乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌均在作用细胞24h时黏附能力开始下降,与本试验结果一致。刘海鸿等研究发现,乳酸杆菌在作用2和4h时黏附能力开始下降,本试验结果与此不同。这种黏附效果和细胞生长状况的差异可能是由于试验菌株类型、使用菌株浓度及其代谢产物、使用细胞类型等不同造成的。丁酸梭菌抑制致病菌黏附结果表明,丁酸梭菌能够显著抑制致病菌黏附,这主要可能是由于丁酸梭菌竞争性黏附细胞以后占据了黏附位点,抑制致病菌与肠上皮细胞表面的受体结合。但是当致病菌作用时间达到24h时,丁酸梭菌的抑制能力降低,这可能是由于致病菌释放的内毒素等有害物质对细胞产生了毒性作用,影响了细胞及益生菌的正常生理功能。

3.3 丁酸梭菌对IPEC-J2免疫应答的影响

丁酸梭菌作为饲料添加剂,可以通过激活机体的免疫应答,增加免疫球蛋白IgA和IgM的含量,激活自然杀伤细胞和巨噬细胞,从而提高机体的免疫能力。炎症细胞因子是一类可以调节机体炎症反应的多肽类物质总称。IL-8主要由单核-巨噬细胞产生,定向游走到反应部位并释放一系列活性产物,这些活性物质导致机体局部的炎症反应,达到杀菌目的,但是释放较多会引起细胞损伤。IL-1β促进B细胞增殖和分泌抗体,调节免疫应答,参与组织修复等。TNF-α是机体重要的炎性因子,它的主要作用是调节免疫细胞的功能,杀伤肿瘤细胞,引起细胞凋亡和炎症反应,参与组织损伤修复等。本试验结果表明,丁酸梭菌可以上调炎症因子IL-8、IL-1β、TNF-α基因的表达。杨静试验结果表明,随着丁酸梭菌及磷壁酸处理浓度的增加,促炎因子IL-8的mRNA表达量增加,与本试验结果相符。张传健研究发现,与对照组相比,丁酸梭菌组和抗生素组均能提高TNF-α的含量,与本试验结果一致。由此可见,丁酸梭菌对动物肠道免疫起到一定的刺激作用,这种微弱的刺激可引起适量炎症细胞因子的产生,不会损伤肠上皮细胞的完整性,有利于增强肠道黏膜免疫防御功能,对动物肠道健康有一定的积极作用。

综上所述,分离得到的丁酸梭菌培养上清能够抑制产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的生长,且丁酸梭菌对猪肠上皮细胞具有良好的黏附能力,能够有效抑制产肠毒素大肠杆菌和沙门氏菌的黏附,为丁酸梭菌在仔猪日粮中的应用提供科学依据,并且探索出了丁酸梭菌作用细胞的合适浓度和时长,为深入研究丁酸梭菌调节仔猪肠道健康机理奠定了基础。

4 结 论

本研究从健康断奶仔猪粪便中成功分离到一株丁酸梭菌,该分离株能够显著抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌的生长,能够黏附IPEC-J2且能抑制致病性大肠杆菌和沙门氏菌的黏附,上调炎症因子的表达,激活IPEC-J2的免疫反应,对动物肠道健康有一定的积极作用。

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