2020-10-16 16:34:19 点击：

摘要：β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶（glycoside hydrolases,GH）家族，广泛存在于植物、动物和微生物中，主要水解产物为甘露低聚糖。微生物来源的甘露聚糖酶种类多且活性高，但大部分安全性低，其中乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB）甘露聚糖酶具有纯化步骤少、易于提取、安全性高等优点，能够满足食品级工业生产的需求，因此在保健品、饲料、饮料生产等工业中有重要应用前景。本文介绍了天然LAB甘露聚糖酶的产酶条件、分离纯化和酶学特性，简述了近年来甘露聚糖酶的LAB重组表达及其在果汁澄清和制备益生元MOS方面的应用，为LAB甘露聚糖酶的基础研究和开发提供参考和依据。

β-甘露聚糖酶（β-1,4-mannan mannao hydrolase,EC.3.2.1.78,以下简称甘露聚糖酶）属于半纤维素水解酶，能够随机切割β-1,4-D-甘露糖苷键，水解产物为甘露低聚糖（mannanoligo saccharides,MOS）。甘露聚糖酶普遍存在于动、植物及微生物中。微生物甘露聚糖酶种类最为丰富，具有活性高、成本低、提取方便等优点，在食品、饲料、洗涤剂和纺织等工业领域应用广阔。如细菌中的芽孢杆菌（Bacillus sp.）、假单胞菌（Pseudomonas sp.）、弧菌（Vibrio sp.）；真菌中的曲霉菌（Aspergillus sp.）、青霉菌（Penicillium sp.）和放线菌中的链霉菌（Streptomycete sp.）等菌属的研究较多。然而常用产酶菌株生物安全性无法满足食品级领域对高安全性酶日益增长的需求。

乳酸菌（lactic acid bacteria,LAB）作为公认的安全菌株（generally recognized as safe,GRAS），为甘露聚糖酶在保健品和食品等领域中的直接应用提供了安全性保障。近年来，关于LAB甘露聚糖酶的相关研究在不断探索中，包括产酶条件、酶学性质、分离纯化、产酶菌种的筛选、纯化以及利用基因工程技术对甘露聚糖酶的异源表达等。本文就目前已报道的LAB作为直接产酶菌株及甘露聚糖酶异源表达菌株的研究进行综述。

1天然LAB甘露聚糖酶的生产

1.1 产酶菌种及产酶条件

目前已报道的直接产甘露聚糖酶LAB菌株共五株，如表1所示。优化培养基组分和培养条件，是提高产酶水平的有效途径，常见的方法有单因素、正交试验和响应面法（response surface methodology,RSM）等。单因素不涉及因素之间的交互作用，正交试验具有一定的限制性，无法获得全面可靠的因素和水平组合。RSM是利用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的关系，因此可显著提高甘露聚糖酶的产量，也是节省成本的重要方法。赵丹等采用RSM对干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）HDS-01产甘露聚糖酶的培养基组分及发酵条件进行优化，在葡萄糖12.65g/L、初始pH值5.18的条件下发酵18.23h，酶活力可达81.40U/mL，较优化前提高1.33倍。路氏肠杆菌（Enterobacter ludwigii）MY271的产酶条件经RSM优化后，该菌株在魔芋粉14g/L、Na2HPO40.5g/L和MgSO40.01g/L的条件下发酵培养，酶活力可达到62.76U/mL，是初始酶活力的2.09倍。多数细菌和真菌一般以魔芋粉、瓜尔胶、槐豆胶等多聚糖类作为单一碳源，但L. casei HDS-01是在混合碳源条件下，优先利用葡萄糖进行细胞生长，初始葡萄糖耗尽后，魔芋粉继而取代并诱导甘露聚糖酶的产生。适宜浓度的葡萄糖既能保证L. casei HDS-01积累足够的生物量，又不产生葡萄糖抑制效应，而干扰魔芋粉的诱导。细菌产甘露聚糖酶的初始pH值通常为中性或碱性（7.0~9.5），而LAB产甘露聚糖酶的初始pH值在5.0左右，原因在于LAB为嗜酸性的单细胞生物。此外，较真菌而言LAB具有生长速度快，产酶周期短等优点。因此对LAB甘露聚糖酶的研究不仅给工业生产甘露聚糖带来便利，同时也拓展了人们对LAB糖类代谢能力的认识，也为工业化生产高生物安全性的酶提供了菌种来源。

1.2 乳酸菌甘露聚糖酶的结构特征

1.2.1 分离纯化及分子量

LAB甘露聚糖酶多为胞外诱导酶，液体发酵液可通过离心或过滤除去菌体获得粗酶液。甘露聚糖酶分离纯化通常采用硫酸铵分级沉淀法、透析、超滤、离子交换及凝胶过滤等方法。张鑫等使用饱和度65%的硫酸铵沉淀L.casei HDS-01甘露聚糖酶蛋白，以CH3COO－为DEAE-Sepharose Fast Flow凝胶柱洗脱阴离子，对甘露聚糖酶蛋白的洗脱效果最好，纯化后甘露聚糖酶蛋白含量为4.93mg/mL，纯化倍数提高了11.4倍。Nadaroglu等和Adiguzel等分别利用硫酸铵沉淀植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ATCCR14917TM、乳酸片球菌（Pediococcusacidilactici）M17、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）M24和绿色魏斯氏菌（Weissellaviridescens）LB37的甘露聚糖酶蛋白时，饱和度为60%~80%，洗脱阴离子为Cl－，纯化效率依次为74.5%、38.2%、75.6%和49.6%。结果表明，同种不同株来源的甘露聚糖酶在溶解度及阴离子相互吸附的能力上存在较大差别。

不同来源的甘露聚糖酶分子量也不尽相同，细菌来源的分子量通常在37~55kDa。环状芽孢杆菌（Bacillus circulans）NT6.7和尼尔森杆菌（Bacillus nealsonii）甘露聚糖酶的分子量分别为40kDa和50kDa。真菌甘露聚糖酶的分子量一般较高，Chai等报道的绿木霉菌（Trichoderma virens）甘露聚糖酶分子量达到77kDa。LAB甘露聚糖酶的分子量通常为35~55kDa（表1）。L. plantarum M24有两种甘露聚糖酶组分，分别为36.4kDa和55.3kDa。因此，LAB甘露聚糖酶的分子量与细菌的甘露聚糖酶较为相近，普遍小于真菌的甘露聚糖酶。

1.2.2 酶学特性

1.2.2.1 最适反应pH值

细菌甘露聚糖酶的最适反应pH值通常在略酸性到中性范围（5.5~7.0）。真菌甘露聚糖酶作用范围一般偏酸，最适反应pH值为4.0~5.5，如里氏木霉（Trichoderma reesei）甘露聚糖酶的最适pH值为5.5。LAB中，P.acidilactici M17和W.viridescens LB37的甘露聚糖酶最适pH值均为6.0，而L.plantarum M24和L.plantarum ATCC®14917TM甘露聚糖酶的最适pH值分别为8.0和10.0。由此可以看出，LAB甘露聚糖酶的最适反应pH值可以由弱酸性到碱性，与真菌来源的甘露聚糖酶相比，其作用pH值范围更为宽泛。

1.2.2.2 最适反应温度

微生物甘露聚糖酶的最适作用温度为40~65℃。W.viridescens LB37甘露聚糖酶的最适反应温度为40℃，且该酶在30~70℃时仍保持50%以上的活性。Nadaroglu等测定P.acidilactici M17甘露聚糖酶的最适反应温度为60℃，L.plantarum M24甘露聚糖酶的最适作用温度和稳定温度范围分别为50℃和30~70℃。L.casei HDS-01甘露聚糖酶酶活最适反应温度为40℃，然而当温度升至70℃时，相对酶活下降至30%以下，这是由于高温环境破坏了α-螺旋结构的氢键，导致α-螺旋结构解旋的结果。LAB甘露聚糖酶较为宽泛的作用温度区间，提升了LAB甘露聚糖酶在工业应用中的潜力。

1.2.2.3 反应热动力学

微生物甘露聚糖酶以槐豆胶为底物时，Km值通常为0.5～7.8 mg/mL，如密褐褶菌（Gloeophyllumtrabeum）CBS900.73（Km 3.7 mgmL−1，Vmax 2525 μmolmL−1·min−1）和芽孢杆菌（Bacillus sp.）HJ14（7.8 mgmL−1，Vmax 270 μmolmL−1·min−1）。LAB甘露聚糖酶以槐豆胶为底物时，Km值通常为0.01~0.59 mg/mL，如P.acidilactici M17（Km0.592mM，Vmax 78.74 mmolmin−1mg−1）、W.viridescens LB37（Km0.0178 mM, Vmax 82.5 mgmannan mL−1）和L.casei HDS-01（Km2.68 mgmL−1，Vmax400.03 μmolmL−1·min−1）。此外，L.casei HDS-01甘露聚糖酶以瓜尔胶为底物的相对活性比对槐豆胶、果胶和魔芋粉的相对活性高出1~2倍，并且发现瓜尔胶的高亲和力和催化效率与其甘露糖和半乳糖较高比例（4：1）的组成是分不开的。

1.2.2.4 激活剂与抑制剂

金属离子如Fe3+、Ca2+、Mg2+、Zn2+、Mn2+或Co2+等，对甘露聚糖酶有激活或抑制作用，同种金属离子对不同来源的甘露聚糖酶产生的影响不同。Ca2+能够抑制W.viridescens LB37与L.casei HDS-01甘露聚糖酶的活性，却促进枯草芽孢杆菌亚种（Bacillus subtilis subsp.inaquosorum）CSB31嗜碱性甘露聚糖酶的活性。Zn2+能够与P.acidilactici M17和L.plantarum M24甘露聚糖酶的Zn2+结合位点结合，使酶活分别提高4%和286.3%。EDTA是一种金属螯合剂，可以通过去除金属离子以使酶失活。EDTA对L.caseiHDS-01甘露聚糖的酶活力有极强的抑制作用，经EDTA作用后剩余酶活仅在15%左右。不同来源的甘露聚糖酶性质存在显著差异，因此通过改变酶学性质，使甘露聚糖酶达到最佳状态，进而扩充LAB甘露聚糖酶的应用范畴。

2LAB表达重组甘露聚糖酶

目前，天然LAB甘露聚糖酶的生产方面存在酶产量、酶活及自身稳定性较差等问题，难以满足工业化应用需求。为了克服这一系列问题，从而更好的将LAB甘露聚糖酶应用于生产实践，异源表达成为了一种普遍的分子生物学技术，以提高酶产量，降低生产成本，从而获得安全性高的甘露聚糖酶。异源表达常用的重组表达系统是大肠杆菌（Escherichia coli）和毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统，但P.pastoris表达系统尚未批准用于食品级蛋白表达。E.coli含有内毒素，可能在分泌重组蛋白时释放，引起人畜的不良反应，导致机体损伤。相比之下，选择LAB作为异源表达宿主更为安全可靠。

2.1 LAB表达系统

重组蛋白的过量积累可能产生毒素，造成细胞损伤，影响宿主菌的正常生长。此时利用相应的信号肽序列，及时将异源蛋白转移至胞外，可有效减低这种损伤。邹业霞等利用乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）分泌蛋白的信号肽（SPUSP45）构建表达载体，成功实现将短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）甘露聚糖酶基因（manB）在L.casei中的分泌表达，重组酶活可达8.8U/mL，显示出益生菌和益生元协同调节肠道菌群的潜在能力。Lin等将B.pumilus甘露聚糖酶基因manB克隆到表达载体pELX1上，在L.casei中成功表达。manB基因用于测试L.casei分泌表达时，甘露聚糖酶的稳定性较β-葡萄糖苷酸酶更强，因此manB是比β-葡萄糖苷酸酶基因（gusA）更好的报告基因，开拓了manB基因新的用途。

近年来，L.plantarum也被用作甘露聚糖酶基因的异源表达宿主。在L.plantarum WCFS1中，利用pSIP403载体分泌表达B.circulans NT 6.7的manB基因，重组酶的最适作用pH值和温度分别为6.0和50℃，重组酶的活力达27U/mL，是原始酶活力的3.29倍，对半乳甘露聚糖具有较高的底物特异性。Sak-Ubol等利用相同体系表达地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DSM13的甘露聚糖酶基因。为避免抗生素标记的使用，将pSIP403表达质粒上的红霉素抗性基因（eryR）用丙氨酸消旋酶基因（alr）取代，满足了食品级表达载体选用食品级筛选标记的条件。LAB作为食品级宿主生产重组甘露聚糖酶，在食品、MOS制备及果汁产业等领域中具有广泛的应用潜力。

2.2 LAB表面展示系统

常规游离甘露聚糖酶的制备过程复杂、稳定性及重复利用率低，这些因素限制了甘露聚糖酶应用的进一步发展。近年来，LAB表面展示技术的迅速发展为甘露聚糖酶的制备提供了新的视角。LAB表面展示可将甘露聚糖酶和LAB的细胞表面蛋白融合表达，使重组甘露聚糖酶固定在LAB细胞表面。在工业生产过程中，LAB表面展示无需复杂的分离纯化和固定化等步骤，具有成本低、稳定性高、可重复使用等优点，可用于开发全细胞生物催化剂和生物传感器等。B.licheniformis DSM13的甘露聚糖酶基因manB与B.subtilis ATCC 23857的壳聚糖酶基因（csnA），分别通过N端脂蛋白锚定和C端细胞壁锚定与L.plantarum的不同锚定位点融合，在L.plantarum WCFS1中成功表达。L.plantarum WCFS1细胞表面展示的甘露聚糖酶活性可达890U/g，经4次循环使用后，重组甘露聚糖酶酶活虽有下降，但仍保持在80%左右，有良好的可重复利用性。Nguyen等将B.licheniformis DSM13的manB基因与L.plantarum的N末端脂蛋白锚定序列融合，将重组甘露聚糖酶展示在L.plantarum WCFS1的细胞表面，细胞表面酶活性达到3500U/g，通过4次循环使用，重组酶酶活仍保持初始酶活的50%左右。采用LAB表面展示甘露聚糖酶，降低发酵生产成本的同时，避免了繁琐的酶纯化步骤，提高了酶的重复利用率，从而拓宽了甘露聚糖酶的应用前景。

3LAB甘露聚糖酶的应用

现阶段，甘露聚糖酶在饲料、洗涤剂、纺织、造纸及石油钻探等行业有重要作用。在饲料工业，甘露聚糖酶具有消除抗营养因子β-D-甘露聚糖的作用，促进畜禽生长，提高饲料利用率。在纺织行业，甘露聚糖酶可使苎麻脱胶彻底，减少纤维素损坏，提升纺织品质。尽管甘露聚糖酶的应用广泛，但随着人们对食品级安全问题的日益重视，LAB作为直接产酶来源备受关注，LAB的无毒副作用，为LAB甘露聚糖酶直接应用于医药、保健品及果汁饮料等行业提供安全性保障，从而使LAB甘露聚糖酶的地位及热度也逐年上升。现已报道的LAB甘露聚糖酶主要应用在果汁澄清和制备益生元MOS两个方面。

3.1 在果汁澄清中的应用

大部分果汁原料中含有甘露聚糖，导致提取物粘稠度高，增加了果汁加工难度。甘露聚糖酶制剂已广泛应用于果汁生产，降解甘露聚糖，降低粘稠度，提高出汁率和澄清效果，改善果汁品质和外观。Nadaroglu等报道了P.acidilactici M17和L.plantarum M24甘露聚糖酶用于橙汁、杏汁、葡萄汁、苹果汁和桃汁的澄清作用。Adiguzel等利用甘露聚糖酶澄清猕猴桃汁效果最佳，澄清率为117.21%。赵丹等发现L.casei HDS-01甘露聚糖酶用于橙汁的澄清效果较好，澄清率提高到156%。与纯酶制剂相比，产甘露聚糖酶的LAB菌株可直接用于果汁加工，既能够保证食用安全性，还能降低生产成本。

3.2制备益生元MOS

人体及家畜无法直接消化吸收MOS，但MOS在肠道内被双歧杆菌（Bifido bacterium）、乳酸杆菌（Lacto bacillus）等所利用，促进有益菌的生长，调节肠道的微生态平衡。LAB来源的甘露聚糖酶亦具有制备MOS的能力。B.licheniformis DSM13的manB在异源表达宿主L.plantarum中表达，通过表面展示固定化甘露聚糖酶能够产生安全、稳定的食品级生物催化剂，将半乳甘露聚糖分解成益生元MOS。Nguyen等成功在L.plantarum WCFS1细胞表面展示重组甘露聚糖酶，将该细菌用作全细胞生物催化剂，以生产益生元MOS。

4结语

随着对半纤维素资源的开发和功能性低聚糖MOS益生作用的研究，甘露聚糖酶的研究已取得较大程度的进展，在保健品、饲料等行业广泛应用。LAB作为甘露聚糖酶的直接产酶菌株提供了诸多便利，具有食品安全级的保障和益生作用，符合绿色、经济、环保的可持续发展理念。为使LAB来源的甘露聚糖酶能够更广泛的应用于工业化量产，需提高LAB甘露聚糖酶的环境适应性、酶活力及产酶水平等。LAB甘露聚糖酶的研究将集中在以下几个方面：第一，挖掘直接产甘露聚糖酶的LAB菌株资源，为酶的食品级应用提供生成菌种；第二，优化产酶条件，为工业化生产提供工艺参数；第三，利用分子生物学手段构建食品级表达系统，提高甘露聚糖酶的安全性及产量。

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