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微生物发酵爆破秸秆降解纤维素的研究
2020-02-10 16:11:54      点击:

木质纤维素是地球上数量最大的可再生能源物质,据初步统计,全世界每年产量大约为100亿t,其中农作物秸秆的产量为70亿t。然而,植物细胞壁中半纤维素和木质素的复杂结构及其对纤维素的包裹作用限制了秸秆资源在畜牧业生产中的大量应用。目前,在工业和饲料生产中实际使用的秸秆大约占总量的30%,其余大部分都被直接燃烧或丢弃,造成了很大的资源浪费和环境污染。因此,促进秸秆中纤维成分的降解,合理地利用秸秆资源,对于畜牧业生产和经济发展具有非常重要的意义。

生物处理是一种安全、环境友好、低能耗的传统的秸秆处理方法。然而,较低的水解效率和较长的反应时间限制了其在实际生产中的应用。为了提高生物处理的效果,必须采取一些物理或化学的预处理方法来软化或破坏木质纤维素的结构。蒸汽爆破是采用饱和水蒸汽加热原料至一定的压力,然后骤然减压至大气压的生物质预处理手段。蒸汽爆破预处理可使原料中大部分半纤维素、少量木质素和纤维素降解而溶出,有利于后续纤维素酶对纤维素的降解,是玉米秸秆预处理的有效方法之一,规模化的生产可以节省能耗和成本。许多研究表明,蒸汽爆破处理可以提高动物对谷物秸秆的消化率。目前,国内外将秸秆爆破技术应用到动物饲料生产方面的研究较少。鉴于此,将秸秆爆破预处理和微生物发酵相结合,并对爆破秸秆微生物发酵生产动物饲料的发酵培养基进行优化,旨在为秸秆饲料资源的开发及其在畜牧业生产中的应用提供参考。

1材料与方法


1.1 试验材料

玉米秸秆经粉碎机粉碎后,过5 mm筛备用。试验所用米曲霉菌种为河南农业大学动物营养与生物技术实验室分离、鉴定和保存。

1.2试验设备

秸秆蒸汽爆破机为LB系列数控立式连续汽爆机。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

玉米秸秆在秸秆爆破机中于2.5 MPa下维压200 S,然后在0.008 75 s内突然释放压力,进行爆破预处理,处理后的样品自然晾晒于燥备用。

1.3.2 种曲的制备和培养

将分离纯化后的米曲霉菌株接种到PDA培养基中,30℃条件下静止培养3 d,然后用无菌加有吐温的生理盐水冲洗平板,轻轻将琼脂平面上的孢子刮下,转移到已经灭菌的三角瓶中,采用平板计数法计算种曲孢子密度为1×106个/mL左右。

1.3.3 试验设计与分组

正交试验设计见表1。


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营养液的配比为:尿素25%、葡萄糖25%、磷酸二氢钾12.5%、硫酸镁12.5%、硫酸锰10%、硫酸锌10%、氯化钴5%。

以上培养基用2%的Ca(OH):讽整pH值为中性后,121℃高压灭菌15 min,按照固液比1:1.5,接种量为4%进行接种,30℃培养6 d,测定发酵后产品的纤维素降解率、滤纸酶活性和羧甲基纤维素(CMC)酶活性。

1.3.4 理化指标的测定

发酵后的秸秆样品,在50℃条件下烘干至恒质量,一部分用于测定秸秆中纤维素含量。另取4.0 g发酵样品,加入36 mL生理盐水浸泡2 h后,3 000 r/min离心10 min,取上清液作为粗酶液,测定其滤纸酶活性和CMC酶活性。

秸秆中纤维含量的测定采用范氏(Van Soest)纤维测定方法。

滤纸酶活性的测定:取粗酶液和煮沸10 min灭活的酶液各0.5 mL,加入1.5 mL浓度为0.05mol/L、pH值为4.5的柠檬酸缓冲液和50 mg滤纸条,于50℃条件下水浴保温1 h,然后加入1.5 mL的DNS显色液,煮沸5 min,以灭活酶组为对照,在波长550 nm处测定吸光度。酶活性单位定义为:以水解反应每小时催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量为1个单位。

CMC酶活性的测定:取粗酶液和煮沸10 min灭活的酶液各0.5 mL,加入1.5 mL质量分数为0.51%的CMC柠檬酸缓冲液中,在50℃恒温水浴锅中酶解30 min,加入1.5 mL DNS显色液终止反应,充分混匀后,沸水浴15 min,以灭活酶组为对照,在波长550 nm处测定吸光度。

1.4 数据统计和分析

试验数据均以“平均值±标准差”(mean±SD)表示,结果用SAS统计软件中ANOVA过程进行方差分析,并进行Duncan多重比较,P<0.05为差异显著。

2结果与分析


2.1 发酵爆破玉米秸秆中纤维素降解最优培养基的确定

由表2可知,秸秆发酵纤维素降解率最高的条件为:爆破玉米秸秆83.5%、玉米5.0%、麸皮2.5%、豆粕5.0%、营养液4.0%。营养液的R值最高,其次为麸皮和豆粕,玉米的R值最小,表明培养基成分对纤维素降解的影响程度依次为营养液、麸皮、豆粕和玉米,营养液是影响纤维素降解的最主要因素。


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由表3可知,营养液、豆粕和玉米的不同水平对纤维素降解的影响达到了极显著水平(P

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2.2 发酵爆破玉米秸秆中滤纸酶活性最优培养基的确定

由表4可知,玉米、麸皮、豆粕、营养液的最高κ值分别在水平3、水平2、水平3、水平3。培养基中成分对滤纸酶产生的影响程度依次为营养液、麸皮、玉米和豆粕,营养液是影响滤纸酶产生的最主要因素。

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由表5可知,营养液和麸皮的不同比例对滤纸酶活性的影响达到了显著水平(P

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2.3 发酵爆破玉米秸秆中CMC酶活性最优培养基的确定

CMC酶活性优化培养基为:爆破玉米秸秆86.0%、玉米2.5%、麸皮2.5%、豆粕5.0%、营养液4.0%。营养液的R值最高,其次为豆粕和玉米,麸皮的R值最小,这表明培养基成分对CMC酶活性产生的影响程度依次为营养液、豆粕、玉米和麸皮,营养液是影响CMC酶产生的最主要因素。

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由表7可知,营养液、豆粕、玉米和麸皮的不同比例对CMC酶活性的影响均达到了显著水平(P<0.05)。

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3讨论


本试验中,纤维素降解率最高的组合为A3B2G3D3,滤纸酶和CMC酶活性产生最高的组合分别为A3B2C3D3和A2B2C3D3。滤纸酶活性产生最高的组合,纤维素的降解率也最高。


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